Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Министерствообразования и науки Российской Федерации

Сибирскийфедеральный университет

Учебно-методическоепособие

кпрактическим занятиям

Специальность 020208.65 – Биохимия

Красноярск

СФУ

2012

УДК577.15(07)

ББК28.072.534

Составитель: н.М.Титова

Кинетикаи термодинамика ферментативных реакций:Сборник задач к практическим занятиям/[Текст] / сост. Н.М. Титова.– Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 64с.

Сборник задач по курсу «Кинетика итермодинамика ферментативных реакций»составлен в соответствии с программойкурса и является учебно-методическимруководством по решению задач покинетическим свойствам ферментов.

Вучебном пособии представлены четкоструктурированные задачи по основномуразделу курса «Кинетика ферментативныхреакций» разной степени сложности.Предназначено для студентов биологическихи медико-биологических специальностейуниверситетов.

УДК577.15(07)

ББК28.072.534

©Сибирский

федеральный

университет,2012

ВвЕдение

Вферментативной кинетике концепциястационарности применима к концентрациямсвязанных с ферментом интермедиатов.

Когда фермент смешивается с избыткомсубстрата наблюдается начальный период,известный как предстационарное состояние,в течение которого концентрации этихинтермедиатов достигают стационарногоуровня.

По достижении интермедиатамистационарных концентраций скоростьреакции относительно медленно изменяетсясо временем и именно в данный периодтрадиционно измеряют скоростиэнзиматических реакций.

Стационарноесостояние является аппроксимацией,поскольку субстрат постепенно превращаетсяв ходе эксперимента.

Но, принимая вовнимание, что измерения осуществляютсяза короткий промежуток времени, когдаконцентрация субстрата изменяетсянезначительно, стационарное состояниеявляется хорошей аппроксимацией.

Хотяизучение предстационарной кинетикипозволяет анализировать механизмыферментативного катализа, стационарнаякинетика более важна для измерениякаталитической активности ферментапри стационарных состояниях в клетке.

Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен

ВпервыеА. Браун (BrownA.J.)и затем В.Анри (HenriV.

)в начале ХХ века высказали предположениео том, что в основе ферментативнойреакции лежит обратимое взаимодействиссубстрата с ферментом с образованиемкомплекса, который далее распадаетсяс образованием продуктов реакции ирегенерацией исходного фермента. Этагипотеза была далее развита в работахМихаэлиса (L.Michaelis)и Ментен (M.L.Menten)(1913 г.) и позднее – Бригсом (G.E.Briggs)и Холденом (J.B.S.Haldane)(1925 г.).

Кинетическуюсхему простейшей одностороннейферментативной реакции превращенияодного субстрата в продукт можнопредставить следующим образом:

(1.1)

Ферментативнаяреакция протекает в два этапа. На первомэтапе фермент и субстрат образуютфермент-субстратный комплекс ES.Этот этап является быстрым и обратимым,он не сопровождается какими-либохимическими изменениями субстрата.

Константы скорости реакции образованияфермент-субстратного комплекса иобратного его распада равны соответственноk+1и k-1.

В образовании фермент-субстратногокомплекса (ФСК, комплекс Михаэлиса)принимают участие нековалентныевзаимодействия.

Каталитическийпроцесс осуществляется на втором этапереакции с константой первого порядкаk+2(kcat,число оборотов фермента).

КомплексМихаэлиса распадается с образованиемконечного продукта реакции Р и регенерациейисходного фермента.

Распадфермент-субстратного комплекса можетпроисходить по-разному: в даннойкинетической схеме он распадается водну стадию, но в других случаях этихстадий может быть несколько.

Исходяиз уравнения (1), можно расписать уравнениядля скоростей отдельных стадий реакции.

Скоростьобразования фермент-субстратногокомплекса:

.

Скоростьобратной реакции (диссоциации комплексана исходные вещества):

.

Скоростьраспада комплекса ESс образованием продуктов реакции ирегенерацией фермента:

.

Стационарноетечение процесса возможно тогда, когдаконцентрация субстрата существеннопревосходит концентрацию фермента([S]>>[E]).В этом случае распад комплекса ESпо реакциям (+2) и (-1) уравновешиваетсяего образованием по реакции (+1). Поэтомудля условия стационарности можнозаписать:

или

.

Обозначивобщую концентрацию фермента через [E]0,при условии, что [E]0= [E]+ [ES],преобразуем предыдущее уравнение

.

Откудаконцентрация фермент-субстратногокомплекса будет равна

.

Обозначив

,

получим

.

Скоростьферментативной реакции, измеряемаясогласно схеме (1) по образованию продуктареакции Р из комплекса ES,может быть выражена следующим образом

.

Подставляяв это выражение найденное значение[ES],получаем

Данноеуравнение отражает зависимость скоростиферментативной реакции от концентрациифермента и субстрата. Константа Кмносит название константы Михаэлиса иимеет размерность концентрации субстрата.Уравнение (2) свидетельствует, чтозависимость скорости ферментативнойреакции от концентрации субстрата при[E]0=constявляется гиперболической функцией(рис. 1.1).

Рис.1.1.Зависимость скорости ферментативнойреакции от концентрации субстрата

Криваяпредставляет собой равнобочную гиперболу.При достаточно малых концентрацияхсубстрата, когда [S]> Км,можно принять, что Км+ [S]≈ [S],и тогда

v≈ k+2[E]0= Vmax,

ареакция имеет нулевой порядок поотношению к субстрату. Следовательно,при достижении определенной концентрациисубстрата скорость ферментативнойреакции достигает максимального значенияVmaxи при дальнейшем увеличении концентрациисубстрата не изменяется.

Смыслтакого рода зависимости очевиден:скорость ферментативной реакцииопределяется в целом концентрациейфермент-субстратного комплекса и прималых концентрациях субстрата концентрациякомплекса Михаэлиса пропорциональна[S],тогда как при избытке субстрата фактическивесь фермент находится в форме ES.Дальнейшее повышение концентрациисубстрата не приводит к увеличению[ES].

Сучетом приведенного выше выражения,окончательное уравнение зависимостискорости ферментативной реакции отконцентрации фермента и субстратаприобретает вид

. (1.3)

Уравнение(3) является фундаментальным уравнениемферментативной кинетики и обычноназывается уравнением Михаэлиса-Ментен.

Скоростьреакции приближается к максимальнойдостаточно медленно, и даже при [S]=10Км,величина скорости достигает только0,91 Vmax.В связи с этим значение максимальнойскорости очень часто трудно измеримои его приходится рассчитывать изскоростей, наблюдаемых при концентрацияхсубстрата ниже насыщающих.

Источник: https://studfile.net/preview/4167749/

ПОИСК

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций
    ТЕРМОДИНАМИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ 367 [c.367]

    ТЕРМОДИНАМИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ [c.367]

    ТЕРМОДИНАМИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ [c.371]

    Методы анализа температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций основываются на классических принципах термодинамики и кинетики [1]. [c.263]

    Влияние температуры на реакции, катализируемые ферментами, по существу не отличается от влияния температуры на любые другие химические реакции. Поэтому методы обработки температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций также основываются на классических принципах термодинамики и кинетики (см. гл. 4). [c.249]

    Фотосинтез – единственный из всех типов химических реакций (термических, каталитических, ферментативных, радиационных и фотохимических), позволяющий при мягких термобарических параметрах биосферы осуществить невероятную, с точки зрения термодинамики химическую реакцию, протекающую с увеличением свободной энергии. Он обеспечивает прямо или косвенно доступной химической энергией все земные организмы и, как будет показано ниже, является источником образования горючих ископаемых. Обратный фотосинтезу процесс представляет собой знакомую всем нам химическую реакцию горения твердых, жидких и газообразных горючих ископаемых с выделением большого количества энергии. Следовательно, растительный и животный мир, а также органические горючие ископаемые Земли есть не что иное, как аккумулированная энергия Солнца На современном этапе эволюции Земли ежегодно в результате фотосинтеза образуется 150 млрд т органи- [c.50]

    Иванов и Карпейский считают многоточечное связывание причиной стабилизации активной электронной конфигурации, термодинамически невыгодной в гомогенном растворе, и причиной надлежащей ориентации реагирующих групп.

Существование в активном центре по крайней мере двух пространственно различных структур (в случае ААТ двух различных ориентаций коферментного цикла) обеспечивает выполнение указанных условий в многостадийной ферментативной реакции.

Условия оптимальности каждой последовательной стадии обеспечиваются структурной перестройкой, происходящей в предыдущей стадии. На языке термодинамики изложенное означает, что в активном центре происходит выравнивание уровней свободной энергии промежуточных соединений.

В случае ААТ этот эффект проявляется в спектре поглощения ФСК (рис. 6.17), содержащем полосы поглощения практически всех [c.381]

    Для изучения механизма действия ферментов большое значение имеет исследование влияния температуры на скорость реакции при отсутствии тепловой инактивации.

Это влияние, разумеется, по существу не отличается от влияния температуры на любые другие химические реакции и, следовательно, подход к количественной характеристике этого явления основывается на классических принципах термодинамики и кинетики.

Однако использование таких принципов применительно к ферментативным реакциям оказывается гораздо более сложной задачей, вследствие сложности механизмов ферментативных реакций. [c.126]

    Я начну с релаксационной концепции ферментативного катализа. Первое указание на отклонение каталитического акта ферментативной реакции от классической термодинамики и классической кинетики было, по-видимому, высказано в 1971 году [34]. Было показано, что применение основных постулатов Аррениуса и Эйринга к большинству ферментативных процессов может привести к бессмысленным значениям активационных параметров. Функционирование фермента больше похоже на работу механической конструкции, чем на обычную каталитическую химическую реакцию. Феноменологическая самосогласованная релаксационная теория ферментативного катализа была предложена в 1972 году [35,36]. Принципиальная идея релаксационной концепции заключается не просто в том, что конформационная [c.67]

    В первой главе даются общие понятия о типах химических связей, основные представления о механизме ферментативных реакций и их общие схемы. На основе законов термодинамики и химической кинетики кратко изложена теория активации молекул, кинетика ферментативного процесса и влияние температуры и реакции среды на биокаталитические процессы. [c.3]

    Так как ферментативный катализ приводит к снижению энергии активации, то следует хотя бы кратко остановиться на основных положениях термодинамики и кинетики ферментативных реакций. [c.18]

    Трудно сказать, какими соображениями руководствуется фермент при выборе пути активации субстрата.

Во всяком случае, изучение кинетики ферментативной реакции и термодинамики образования промежуточных комплексов, хотя и дает ценную количественную информацию, не позволяет полностью раскрыть молекулярный и электронный механизм работы фермента.

Здесь, как и нри изучении обычных химических реакций, приходится идти по пути моделирования — грубо говоря, придумывания таких молекулярных механизмов, которые по крайней мере не противоречили бы данным эксперимента и элементарной логике химических реакций.

Беда в том, что при достаточно развитом воображении таких хороших механизмов можно придумать довольно много. Ниже мы познакомимся с некоторыми из таких модельных представлений, а теперь посмотрим, как исследователи устанавливают природу активных центров ферментов. [c.97]

    С термодинамической точки зрения ферменты и другие катализаторы можно определить как вещества, увеличивающие скорость химических реакций или обусловливающие возможность протекания этих реакций путем снижения величины свободной энергии активации.

Как и все положения термодинамики, это определение затрагивает только энергетический баланс реакций и оценивает возможность протекания этих реакций с термодинамической точки зрения оно, однако, не дает никакого представления о самом механизме ферментативных реакций, т. е.

о природе реагирующих групп фермента и субстрата и о характере промежуточных соединений. [c.286]

    Термодинамика ферментативного катализа. Известно, что ферменты ускоряют реакции, увеличивая их константы скорости. Обычно рассмотрение этого эффекта проводят в рамках теории переходного состояния, или активированного комплекса (рис. XIV. ).

Считают, что реагенты, находящиеся исходно в основном состоянии, образуют комплекс, который активируется с образованием переходного состояния. Этому состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакции. Продукты реакции возникают при движении вдоль координаты реакции из переходного состояния.

В теории активированного комплекса предполагают что существует термодинамическое равновесие между переходным и основным состояниями, которому соответствует константа равновесия, равная отношению концентраций активных комплексов и исходных реагентов Тогда по разности свободных энергий этих состояний можно найти концентрацию переходного комплекса, а затем скорость реакции путем умножения этой концентрации на константу скорости его распада. [c.419]

    Из сказанного в предыдущих главах видно, что, возможно, наиболее важной проблемой при теоретическом и экспериментальном анализе биологических реакций и транспортных процессов является установление взаимозависимости между силами и потоками. Необходимы такие соотношения, с помощью которых стал бы возможным самосогласованный анализ данных при разнообразных условиях.

Для несопряженных потоков такими соотношениями являются закон Фика и закон Ома, а также описание кинетики ферментативных реакций Михаэли-са — Ментен. Главное их достоинство состоит в легкости, с которой эти соотношения поддаются обработке. Попытка учесть влияние сопряженных потоков привела к созданию аппарата линейной неравновесной термодинамики. [c.

88]

    Принцип детального равновесия используется в термодинамике для того, чтобы установить ограничения, налагаемые на вероятность переходов между различными квантовыми или другими состояниями. Этот принцип применим также и к химическим ферментативным реакциям, если рассматривать каждое промежуточное соединение или конформацию как состояние .

Принцип детального равновесия требует, чтобы переходы между двумя любыми состояниями в равновесии происходили с равной частотой в прямом и обратном направлениях [55].

Это означает, что процесс А->В точно уравновешен процессом В->А и, таким образом, равновесие не может поддерживаться за счет циклического процесса, при котором в одном направлении идет реакция А В, а в противоположном В С А.

В другой формулировке, более удобной для кинетических исследований, этот принцип гласит, что в равновесии прямая реакция протекает по пути, в точности противоположному пути протекания обратной реакции. Другими словами, переходные состояния для прямой и обратной реакций идентичны. Это справедливо также для (нецепных) реакций в стационарном состоянии [56]. [c.92]

    Чтобы установить механизмы, по которым белки усиливают каталитическую активность металлокомплексов, необходимо прежде всего выделить отдельные стадии и промежуточные продукты суммарного ферментативного процесса, а затем сравнить константы скоростей отдельных стадий с константами скоростей аналогичных реакций, протекающих в отсутствие белка.

Далее надо выяснить, определяется ли наблюдаемое ускорение той или иной стадии процесса влиянием белка на кинетику или на термодинамику (т. е. на равновесие, в котором участвует только субстрат, только ион металла или некоторое промежуточное соединение).

Трудно ожидать, что нам удастся понять, каким образом белок влияет на константы скорости (которые связаны с разностью свободных энергий между основным состоянием с более или менее известной структурой или переходным состоянием, структура которого, как правило, неизвестна), до тех пор, пока не будет изучено влияние белка на константы равновесия (которые связаны с разностью свободных энергий между двумя основными состояниями). [c.135]

    До тридцатых годов нашего столетия механизмы биохимических реакций оставались во многом неясными. Это положение резко изменилось с тех пор, когда в биохимии стали использоваться принципы термодинамики (энергетики).

Это позволило в значительной мере расшифровать имеющиеся в живых организмах ферментативные механизмы, посредством которых осуществляется использование химической энергии в клетке и превращение химической энергии в иные виды энергии, необходимые для ее жизнедеятельности. [c.10]

    Ферментативный катализ. Наиболее удивительными катализаторами являются ферменты, катализирующие бесчисленные реакции в живых организмах. В соответствии с термодинамикой большинство органических веществ можно превратить в продукты, обладающие более низкой свободной энергией. Находящиеся в живой клетке ферменты определяют, какие из этих реакций и с какой скоростью будут осуществляться.

Все известные ферменты являются белками, т. е. полимерами, состоящими из аминокислот и имеющими определенную пространственную структуру полипептидных цепей. Сами ферменты имеют молекулярные веса порядка 15 000, но некоторые из них, по-видимому, связаны с более сложными структурами клетки. В настоящее время около 150 ферментов выделено в кристаллической форме.

Некоторые из этих ферментов обладают высокой специфичностью и катализируют только одну реакцию другие катализируют большое число реакций данного типа (например,гидролиз эфиров). Ряду ферментов для проявления каталитического действия требуется присутствие определенных ионов металлов или коферментов, т. е.

соединений, которые в ходе каталитического цикла попеременно окисляются и восстанавливаются. [c.364]

    Если равновесие между Е и Е сдвинуто в сторону образования Е, а равновесие между ES и E S — в сторону образования E S (для того чтобы отметить это, мы воспользовались тонкими и жирными стрелками), то S должен связываться более прочно формой Е, чем формой Е, поскольку для соблюдения второго закона термодинамики необходимо, чтобы константа равновесия для полной реакции Е + S E S была одинаковой независимо от пути, по которому совершается переход от Е к E S. Если реакция рас-лада E S Е + Р протекает гораздо быстрее, чем реакции изомеризации Е ->- Е и ES ->-E S, то процесс связывания субстрата не может достичь равновесия. При низких концентрациях S форма Е изомеризуется в Е еще до того, как S успеет с ней связаться. При высоких же концентрациях S последний имеет возможность связаться с Е, прежде чем эта форма превратится в Е. Таким образом, кажущееся сродство фермента к субстрату растет при увеличении концентрации субстрата, или, иными словами, связывание субстрата является кооперативным. Важно подчеркнуть, что реакция E S- -Е -Ь Р должна быть быстрой если эта стадия настолько медленна, что лимитирует скорость ферментативного процесса, нарушения равновесия в связывании субстрата не происходит и насыщение субстратом не может быть кооперативным. [c.196]

    Фотосинтез — единственный из всех типов химических реакций (терм ических, каталитических, ферментативных, радиационных и фо— тохимических), позволяющий при мягких термобарических параметрах б o фepы осуществить невероятную, с точки зрения термодинамики химическую реакцию, протекающую с увеличением свободной энергии. Он обеспечивает прямо или косвенно доступной химической энергией все земные организмы и, как будет показано ниже, является источником образования горючих ископаемых. Обратный фотосинтезу процесс представляет собой знакомую всем нам химическую реак1,,ию горения твердых, жидких и газообразных горючих ископаемых с выделением большого количества энергии. Следовательно, растительный и животный мир, а также органические горючие ископаемые Земли есть не что иное как аккумулированная энергия Солнца На современном этапе эволюции Земли ежегодно в результате фотосинтеза образуется 150 млрд. т органического вещества, усваивается 300 млрд. т СО и выделяется около 200 млрд. т свободног о кислорода. Благодаря только фотосинтезу в первичной атмосфере Земли появился кислород, возник озоновый экран, создались условия для биологической деятельности. При гибели организма происходит обратный процесс [c.43]

    Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

    Как уже отмечалось, понимание структуры и свойств белковых молекул невозможно без учета их водного окружения (см. гл. 4). Рассмотрение ферментов в водном растворе как целостной системы необходимо и для изучения термодинамики ферментативных процессов. Такой системный подход характерен для методологии современной физики.

Вычленение белковых молекул из окружающей их водной среды незакономерно в строгой теории. Это относится и к кинетике. Теория абсолютных скоростей реакций, переносящая на ферменты положения, справедливые для газовых реакций, пригодна лищь для грубых оценок. Теория ферментативных реакций требует учета физических свойств среды. [c.

373]

    Известно, что важнейшие процессы с участием белковых молекул регулируются их окружением. Например, Брюс и Тернер [1] при исследовании модельной ферментативной реакции показали, что при переходе от воды к водно-диоксановому раствору скорость атаки сложных эфиров замещенных фенолов карб-оксилат-ионом изменяется па 4—6 десятичных порядков.

Хотя в отношении значения роли растворителя в подобных процессах мнение исследователей единодушно, до сих пор остаются непонятными основы контролирующего влияния растворителя.

Наш интерес к этой проблеме обусловлен желанием установить зависимость между структурой активных центров, которая следует из рентгенографических данных, и термодинамикой связ-зывания субстратов и их аналогов. Трудность изучения термодинамики реакций с участием белков видна на примере складывания молекулы белка при связывании с аналогом субстрата (табл. 6.1).

Эти реакции характеризуются различиями в величине поверхности контакта более чем на порядок, тогда как различия в изменении свободной энергии и энтальпии невелики. Хотя пути участия растворителя не могут служить отправной [c.114]

    Ферменты представляют собой органические катализаторы, выделяемые живыми организмами, которые воздействуют на вещества, называемые субстратами. Как и все обычные катализаторы, ферменты могут катализировать только те реакции, которые разрешаются законами термодинамики.

Однако число реакций, катализируемых данным ферментом, очень ограничено.

Как мы уже видели в предыдущих главах, в последнее время ферменты начали применять в качестве как бы посредников между определяемым метаболитом и продуктом ферментативной реакции, который можно проанализировать электрохимическими методами.

Такие быстрые и специфичные методы предполагают использование эффективных способов иммобилизации ферментов в искусственных мембранах. Процесс иммобилизации ферментов и роль ферментных электродов в науке о фер.ментах (энзимолопш) детально обсуждаются в литературе [42, 438, 439, 614, 615] (см. также гл. 7, 10, 12-16). [c.203]

    Влияние температуры на скорость ферментативных реакций (186). Зависимость кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций от температуры (186).

Изучение термодинамики конформационных изменений активных центров ферментов (189). Влияние pH на скорость ферментативных реакций (191). рН-зависимость двусубстратной ферментативной реакции (192).

Определение параметров pH-зависимости ферментативной реакции в случае ионизации субстрата (194). [c.711]

    Замечательный (но до сих пор недостаточно оцененный и общепризнанный) английский физик МакКлэйр (С. У. Р. МсС1аге) независимо разработал аналогичный подход, проясняющий механизм получения работы за счет химической реакции, особенно для ферментативных процессов. МакЮ1эйр начал свой глубокий анализ проблемы с новой формулировки второго закона термодинамики, ввел [c.84]

    Значительную часть своего обзора, автор посвящает общей теории катализа нуклеофильных реакций производных карбоновых кислот, без которой нельзя понять механизм ферментативного действия.

Здесь автор кри- ) тйчески анализирует больщой фактический материал по межмолекулярному и внутримолекулярному кислотному, нуклеофильному и электрофильно-нуклеофильному 5 катализу, кинетике и термодинамике реакций у карбо- пильного атома углерода и рассматривает другие во- I просы.

Этот анализ показывает, что каталитическое действие может проявляться как на стадии образова-ния, так и на стадии расщепления промежуточного тетраэдрического продукта присоединения, возникающего при 5к2-реакциях производных карбоновых кислот. [c.6]

Источник: https://www.chem21.info/info/1548575/

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций (стр. 1 )

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Учебно-методическое пособие

к практическим занятиям

Специальность 020208.65 – Биохимия

Красноярск

СФУ

2012

УДК 577.15(07)

ББК 28.072.534

Составитель:

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций: Сборник задач к практическим занятиям /[Текст] / сост. . – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 64 с.

Сборник задач по курсу «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» составлен в соответствии с программой курса и является учебно-методическим руководством по решению задач по кинетическим свойствам ферментов.

В учебном пособии представлены четко структурированные задачи по основному разделу курса «Кинетика ферментативных реакций» разной степени сложности. Предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов.

УДК 577.15(07)

ББК 28.072.534

© Сибирский

федеральный

университет, 2012

ВВЕдение

В ферментативной кинетике концепция стационарности применима к концентрациям связанных с ферментом интермедиатов.

Когда фермент смешивается с избытком субстрата наблюдается начальный период, известный как предстационарное состояние, в течение которого концентрации этих интермедиатов достигают стационарного уровня.

По достижении интермедиатами стационарных концентраций скорость реакции относительно медленно изменяется со временем и именно в данный период традиционно измеряют скорости энзиматических реакций.

Стационарное состояние является аппроксимацией, поскольку субстрат постепенно превращается в ходе эксперимента.

Но, принимая во внимание, что измерения осуществляются за короткий промежуток времени, когда концентрация субстрата изменяется незначительно, стационарное состояние является хорошей аппроксимацией.

Хотя изучение предстационарной кинетики позволяет анализировать механизмы ферментативного катализа, стационарная кинетика более важна для измерения каталитической активности фермента при стационарных состояниях в клетке.

Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен

Браун (Brown A. J.) и затем В. Анри (Henri V.

) в начале ХХ века высказали предположение о том, что в основе ферментативной реакции лежит обратимое взаимодействис субстрата с ферментом с образованием комплекса, который далее распадается с образованием продуктов реакции и регенерацией исходного фермента. Эта гипотеза была далее развита в работах Михаэлиса (L. Michaelis) и Ментен (M. L. Menten) (1913 г.) и позднее – Бригсом (G. E. Briggs) и Холденом (J. B.S. Haldane) (1925 г.).

Кинетическую схему простейшей односторонней ферментативной реакции превращения одного субстрата в продукт можно представить следующим образом:

(1.1)

Ферментативная реакция протекает в два этапа. На первом этапе фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс ES. Этот этап является быстрым и обратимым, он не сопровождается какими-либо химическими изменениями субстрата.

Константы скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса и обратного его распада равны соответственно k+1 и k-1.

В образовании фермент-субстратного комплекса (ФСК, комплекс Михаэлиса) принимают участие нековалентные взаимодействия.

Каталитический процесс осуществляется на втором этапе реакции с константой первого порядка k+2 (kcat, число оборотов фермента).

Комплекс Михаэлиса распадается с образованием конечного продукта реакции Р и регенерацией исходного фермента.

Распад фермент-субстратного комплекса может происходить по-разному: в данной кинетической схеме он распадается в одну стадию, но в других случаях этих стадий может быть несколько.

Исходя из уравнения (1), можно расписать уравнения для скоростей отдельных стадий реакции.

Скорость образования фермент-субстратного комплекса:

.

Скорость обратной реакции (диссоциации комплекса на исходные вещества):

.

Скорость распада комплекса ES с образованием продуктов реакции и регенерацией фермента:

.

Стационарное течение процесса возможно тогда, когда концентрация субстрата существенно превосходит концентрацию фермента ([S]>> [E]). В этом случае распад комплекса ES по реакциям (+2) и (-1) уравновешивается его образованием по реакции (+1). Поэтому для условия стационарности можно записать:

или

.

Обозначив общую концентрацию фермента через [E]0, при условии, что [E]0 = [E] + [ES], преобразуем предыдущее уравнение

.

Откуда концентрация фермент-субстратного комплекса будет равна

.

Обозначив

,

получим

.

Скорость ферментативной реакции, измеряемая согласно схеме (1) по образованию продукта реакции Р из комплекса ES, может быть выражена следующим образом

.

Подставляя в это выражение найденное значение [ES], получаем

Данное уравнение отражает зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата. Константа Км носит название константы Михаэлиса и имеет размерность концентрации субстрата. Уравнение (2) свидетельствует, что зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при [E]0=const является гиперболической функцией (рис. 1.1).

Рис.1.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

Кривая представляет собой равнобочную гиперболу. При достаточно малых концентрациях субстрата, когда [S] > Км, можно принять, что Км + [S] ≈ [S], и тогда

v ≈ k+2[E]0 = Vmax,

а реакция имеет нулевой порядок по отношению к субстрату. Следовательно, при достижении определенной концентрации субстрата скорость ферментативной реакции достигает максимального значения Vmax и при дальнейшем увеличении концентрации субстрата не изменяется.

Смысл такого рода зависимости очевиден: скорость ферментативной реакции определяется в целом концентрацией фермент-субстратного комплекса и при малых концентрациях субстрата концентрация комплекса Михаэлиса пропорциональна [S], тогда как при избытке субстрата фактически весь фермент находится в форме ES. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению [ES].

С учетом приведенного выше выражения, окончательное уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата приобретает вид

. (1.3)

Уравнение (3) является фундаментальным уравнением ферментативной кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса-Ментен.

Скорость реакции приближается к максимальной достаточно медленно, и даже при [S]= 10Км, величина скорости достигает только 0,91 Vmax. В связи с этим значение максимальной скорости очень часто трудно измеримо и его приходится рассчитывать из скоростей, наблюдаемых при концентрациях субстрата ниже насыщающих.

1.1.  Характеристика кинетических констант

В уравнении Михаэлиса есть два кинетических параметра, имеющих важное значение для характеристики любого фермента. Это константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции.

Константа Михаэлиса определяется соотношением констант (k1+k+2/k+1), а величина Vmax, называемая максимальной скоростью, ‒ произведением k+2 [E]0.

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции равна половине максимальной. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной Кm и наоборот, низкое сродство – высокой величиной Км.

Величина Vmax не является фундаментальной характеристикой фермента, поскольку зависит от его концентрации.

Если концентрация фермента известна, то целесообразно ввести величину kcat – каталитическую константу (или число оборотов фермента), определяемую выражением Vmax/[E]0.

Для механизма Михаэлиса kcat идентична k+2, однако в общем случае лучше пользоваться менее определенным обозначением, а именно kcat.

Константу kкат называют еще «числом оборотов» поскольку она соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента за 1 с. Отношение констант kcat/Км называют константой специфичности фермента.

1.2.  Методы определения Км и Vmax

Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса (рис.1.

1), найдя графическим способом максимальную скорость и соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции будет вдвое меньше Vmax. Эта величина [S] и будет Км.

Таким способом можно определить только приблизительную величину константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения Vmax.

Более удобными являются методы, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость v от [S] переведена в линейную.

Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const начальные скорости ферментативной реакции.

Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.)). Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (), в результате чего оно преобразуется в уравнение вида

согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v, v-1) и концентрации субстрата (1/[S], [S]-1) соблюдается линейная зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше представлениям (рис.1.2).

Рис. 1.2. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)

Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] = 1/Км), а ось ординат – в точке (1/v = 1/Vмах). Тангенс угла наклона равен Км/Vмах. Этим широко пользуются для определения параметров Км и Vмах, характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.

Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата.

Графическая зависимость приведена на рис.1.3.

Рис. 1.3. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)

Это прямая с наклоном 1/Vmax, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки Км/ Vmax и – Км соответственно.

Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc.2.3.5) строят график зависимости v от v/[S].

В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует Vmax, а тангенс угла наклона равен – Km.

Данный способ линеаризации приведен на рис. 1.4.

Рис. 1.4. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)

Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они преобразовали в виде зависимости Vmax от Км:

КМ = v + v/[S] VMA

Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость Vmax от Км. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками, отсекаемыми на осях Км и Vmax, соответственно равными – [S] v.

Если провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения Vmax от Км, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.

1.5).

Рис.1.5. Определение кинетических констант – Км и Vmax по методу Эйзенталя и Корниш-Боудена

Преимущества такого графика очевидно: для его построения не требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные данные (такие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).

Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины Кm и Vmax являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-Ментен.

Графические методы для определения Vmax и Кm не являются оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных программ.

1.3.  Задачи к разделу 1

Задача 1.1.. Определить кинетические параметры реакции, катализируемой фосфоглюкомутазой, исходя из данных, приведенных в табл.1.

Таблица 1.1

[Глюкозо-1-фосфат], мкМv, мкмоль/мин*мг белка
2,531,2
5,053,3
1074,5
2094,0
40123,3
80139,2
160152,4

Задача 1.2. Исходя из данных, приведенных в табл. 1.2, определить Км и Vmax данной ферментативной реакции.

Таблица 1.2

[S], мМv, мкмоль продукта/мин
10,9
21,4
51,9
102,3
502,6
1002,8

Задача 1.3. Измеряли кинетику реакции, катализируемой сукцинатдегидрогеназой, в зависимости от концентрации янтарной кислоты. Данные приведены в табл. 1.3. Определите константу Михаэлиса и максимальную скорость данного ферментативного процесса.

Таблица 1.3

[сукцинат] *10-5Мv, мкмоль/мин
0,24,1
0,46,4
0,68,7
0,811,0
1,012,0
3,022,6
9,033,8
15,034,5
21,034,6

Задача 1.4. Исходя из данных табл. 1.4, определить кинетические параметры (КМ, VMAX и kcat) гидролиза субстрата (метилового эфира N-ацетил-L-норвалина), катализируемого α-химотрипсином [E]0 = 2,62 10-7 М.

Таблица 1.4

[S]МvM сек-1
4,009,70
2,007,85
1,336,46
1,005,50
0,804,80

Задача 1.5. Измеряли кинетику ферментативной реакции, катализируемой рибонуклеазой, в зависимости от концентрации РНК. Данные приведены в табл. 1.5. Определить кинетические характеристики реакции (КМ и VMAX).

Таблица 1.5

[РНК]*10-4 Мv, мкмоль/мин[РНК]*10-4 Мv, мкмоль/мин
0,11,33,06,8
0,32,19,08,1
0,52,915,08,5
0,73,518,08,6
1,04,5

Задача 1.6. Измеряли кинетику реакции, катализируемой каталазой в зависимости от концентрации пероксида водорода. Полученные данные приведены в табл. 1.6. Определите КМ и VMAX.

Таблица 1.6

[H2O2], Mv, мкмоль/мин
0,3 *10-510,4
0,5 *10-514,5
1,0 *10-522,5
3,0 *10-533,8
9,0 *10-540,5
13,0*10-541,5
16,0*10-541,6

Задача1.7. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных приведенных в табл. 1.7.

Таблица 1.7

[S] ,М 10-4v0 , моль/мин/мг белка
0,251,0
0,501,7
1,002,5
20,005,0
50,005,2

Задача 1.8. Определить кинетические характеристики очищенного препарата печеночной глюкокиназы по данным, приведенным в табл. 1.8.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Источник: https://pandia.ru/text/78/388/22072.php

§ 12. Кинетика ферментативных реакций

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося  продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:

,

где v – скорость ферментативной реакции,  – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время. 

Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции.

Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента.

Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.

В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:

Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.

Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.

Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.).

При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (Vmax).

При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,

где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; KM – константа Михаэлиса.

Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ Vmax, получаем KM = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.

Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.

Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 оС) повышение температуры на каждые 10 оС в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции  в  2 – 4  раза.

При  высоких  температурах   более 55 – 60  оС активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 оС.

Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.

Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента  максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.

Фермент

рН-оптимум

Пепсин

1,5

Фосфатаза

5,8

Уреаза

6,7

Трипсин

7,7

Каталаза

7,6

Аргиназа

9,7

Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:

a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,

b) ионизацию субстрата,

c) конформацию фермента и его активного центра.

 

Ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами. Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.

Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые. Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением  активности фермента невозможна:

E + I  EI.

Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего.

Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия.

На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов – веществ, ядовитых для насекомых.

Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:

.

Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту.

При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо.  После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.).

Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре,  такое ингибирование называется конкурентным.

Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.

Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий.

ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов.

  Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.

Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).

Рис. 35.  Механизм действия неконкурентного ингибитора 

В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN-. Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.

Аллостерические ферменты

Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36).

С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами. Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента.

Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.

Рис. 36. Структура аллостерического фермента.

Регуляция мультиферментных систем

Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:

В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.

Источник: https://ebooks.grsu.by/osnovi_biohimii/12-kinetika-fermentativnykh-reaktsij.htm

Vse-referaty
Добавить комментарий