Методы биохимических исследований

Биохимические методы исследования

Методы биохимических исследований

Биохимические методы исследования (в диагностике) — методы исследования химических компонентов биологических жидкостей, клеток и тканей, а также процессов превращения веществ и энергии, протекающих в организме человека в норме и патологии.

Для целей клинической диагностики представляет интерес: химический состав биологических жидкостей и тканей организма (патология может проявляться изменением концентрации, или отсутствием одного из обычных компонентов, или появлением необычного компонента), распределение жидкости и химических компонентов между различными «структурами» организма и отдельной клетки, процессы превращения химических компонентов в целом организме или различных его органах и их регуляция с помощью медиаторов, гормонов, тканевых гормонов, ферментов; процессы обмена организма с внешней средой. Исследованию подвергаются входящие в состав живых организмов неорганические, органические вещества и макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Исследование может проводиться in vitro в пробах биологических жидкостей (кровь, моча, цереброспинальная жидкость, нот, пищеварительные соки и т. д.), патологических жидкостей (отечной, асцитической, плевральной, перикардиальной, внутрисуставной и т. д.) или ткани, а также выдыхаемого воздуха, in vivo с помощью введенных в организм датчиков (ионоселективных электродов).

В диагностической практике наибольшее распространение получили Б. м. и. отдельных хим. компонентов, их соединений и соотношений между ними в пробах биол, жидкостей (кровь, моча и т. д.). В зависимости от характера исследования Б. м. и.

могут быть разделены на качественные (обнаружение искомого вещества в пробе биол, жидкости или ткани) и количественные (определение или измерение его содержания). Качественные методы (см. Аналитическая химия) большей частью основаны на использовании характерного для исследуемого вещества свойства, проявляющегося при определенном хим.-физ.

воздействии (прибавление соответствующего реагента, нагревание и т. п.). Этот же принцип лежит в основе прямых количественных методов исследования. Однако поскольку состав биол, жидкостей довольно сложен, при количественном определении хим.

компонента обычно в качестве первого этапа исследования выделяют из биол, жидкости искомое вещество (или группу близких веществ), а затем идентифицируют его (по тому или иному характерному свойству) и измеряют содержание (концентрацию).

В ряде случаев разделение веществ, идентификация и измерение концентрации могут быть проведены одномоментно, напр, при исследовании биол, жидкости методом газовой хроматографии (см. Хроматография). Принципы химических, физических и физико-химических методов, применяемых при биохим, анализе, приведены в табл. 1 и 2.

При исследовании ферментов большей частью измеряют не их концентрацию, а результат проявления их каталитической активности (уменьшение содержания субстрата или увеличение содержания продукта реакции, катализируемой ферментом).

Ряд веществ, обладающих высокой биол, активностью, но содержащихся в организме в малых количествах (гормоны, медиаторы), выделяют тем или иным хим.

способом, а измерение содержания (концентрации) производят с помощью биол, тест-объектов (изолированных органов или целых организмов экспериментальных животных), что повышает чувствительность и специфичность исследования. В последнее время эти биол, методы вытесняются радиоиммунологическими.

Совершенствование Б. м. и. направлено на получение наиболее точной информации о состоянии процессов обмена вещества в целом организме, в определенном органе, в отдельной клетке, в субклеточных структурах. Б. м. и. при этом сочетаются с методами иммунологии, гистологии, цитологии и др. Такие методы обычно сложны, трудоемки, требуют специального оборудования.

Другим направлением развития Б.М. невызываемого запросами клинической диагностики, является разработка и применение максимально упрощенных по технике выполнения и быстрых методов, позволяющих в течение нескольких минут и даже секунд получить приближенную (ориентировочную) оценку определенного биохим, показателя. Б. м. и.

могут осуществляться с помощью частично или полностью механизированных систем, автоматических измерительных приборов, автоанализаторов (см.). Как выделение вещества из биол, жидкости, так и измерение его концентрации может быть осуществлено различными способами. Комбинации этих способов, представляющие собой конкретные методы исследования, довольно многочисленны.

В отношении некоторых веществ (холестерин, холинэстераза) описано до 100—150 вариантов методов исследования. Известная специфика метода исследования может быть обусловлена характером исследуемой биол, жидкости в зависимости от концентрации белка, пигментов и т. п.

Наряду с однократными исследованиями в диагностике представляет интерес изучение того или иного показателя в динамике — в течение суток (оценка нормального суточного ритма), под влиянием определенной функциональной нагрузки (выявление скрытых дефектов метаболизма), в процессе развития болезни, под влиянием лечения.

В связи с многообразием биохимических процессов, одновременно протекающих в процессе жизнедеятельности организма, в практике все шире применяются комбинации диагностических тестов, отражающих ту или иную форму патологии, поражение определенного органа, глубину или стадию патологического процесса.

Применение Б. м. и. в диагностике предъявляет к ним особые требования: использование минимального объема биол, материала, быстрое выполнение анализа, возможность многократного применения при проведении функциональных проб, отсутствие влияния леч. препаратов на результаты исследования и т. д. При оценке Б. м. и.

учитывается: правильность и воспроизводимость результатов от одного определения к другому, точность полученного результата истинному содержанию искомого вещества в пробе, специфичность (способность выявлять вещество независимо от присутствия других веществ) и предел чувствительности (наименьшее количество вещества, к-рое можно определить данным методом).

Разнообразие Б. м. и. предоставляет возможность выбора метода, оптимально соответствующего задачам и условиям научного исследования. В практической деятельности клинико-диагностических лабораторий более целесообразно использовать тщательно отобранные унифицированные методы, единые для всех леч.

-проф, учреждений страны, что позволяет сравнивать результаты анализов, проведенных одному и тому же больному в разных учреждениях, и облегчает материально-техническое снабжение лабораторий. В СССР проводится планомерная унификация наиболее часто применяемых в диагностических целях Б. м. и. с учетом научно-мед. и экономических критериев.

Отечественная номенклатура лабораторных диагностических исследований насчитывает 150 биохим, тестов.

Таблица 1. ПРИНЦИПЫ МЕТОДОВ РАЗДЕЛЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Свойство, используемое для разделения веществМетоды разделения и выделенияСвойство, используемое для разделения веществМетоды разделения и выделения
Различие температур перехода вещества из одного состояния в другое1.    Перегонка (дистилляция)2.    Микродиффузия (изотермическая дистилляция)3.    Выпаривание (высушивание)4.    СублимацияРазличие распределения между подвижной и неподвижной фазами (на основе различия растворимости, сорбируемости, величины молекул или электрического заряда)(продолжение)10.2.2. Разделительная (жидкая стационарная фаза)10.2.2.1.    Жидкостно-жидкостная10.2.2.2.    Газо-жидкостная 10.3. Гельхроматография10.3.1.    Гельфильтрация10.3.2.    Гельхроматография10.3.3.    Разделение без различия величины молекул10.4. По технике осуществления10.4.1.    Колоночная10.4.2.    Тонкослойная10.4.3.    Бумажная
Различие растворимости5.    Экстракция6.    Противоточное распределение7.    Фракционное осаждение (по видам осаждающих агентов и средств)7.1.    Нейтральные соли7.2.    Гидрофильные органические растворители7.3.    Водорастворимые недиссоциирующие высокомолекулярные полимеры7.4.    Тяжелые металлы и их гидроокиси7.5.    Органические катионы7.6.    Анионы и полианионы7.7.    Иммунопреципитация
Различие в электрическом заряде молекул11.    Электрофорез11.1.    Свободный11.2.    На носителях11.2.1.    На бумаге11.2.1.1.    Простой11.2.1.2.    Высоковольтный11.2.2.    На геле агара11.2.3.    На геле агарозы11.2.4.    На крахмальном геле11.2.5.    На полиакриламидном геле11.2.5.1.    Простой11.2.5.2.    Диск-электрофорез11.2.5.3.    Пластинчатый11.2.6.    На пленке (ацетатоцеллюлозы)11.2.7.    На тонком слое12.    Комбинированный электрофорез12.1.    Электрофорез + иммунодиффузия (Иммуноэлектрофорез)12.2.    Электрофорез + хроматография (техника «отпечатков пальцев»)
Различие скорости седиментации8. Седиментационный анализ8.1.    Центрифугирование8.2.    Ультрацентрифугирование8.2.1.    При разных скоростях осаждения частиц8.2.2.    Изопикническое8.2.3.    При зональных роторах
Различие величины молекул9. Диализ9.1.    При равном давлении9.2.    При повышенном давлении9.3.    При пониженном давлении (ультрафильтрация)9.4.    Электродиализ9.5.    Диализ через нестационарную мембрану
Различие в электрическом заряде молекул при определенной величине pH13. Изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH13.1.    Свободное13.2.    Зональное13.3.    В геле13.4.    Иммуноэлектрофокусирование
Различие распределения между подвижной и неподвижной фазами (на основе различия растворимости, сорбируемости, величины молекул и электрического заряда)10. Хроматография10.1.    По виду процессов разделения10.1.1.    Элюционная10.1.2.    Фронтальный анализ10.1.3.    Вытеснительная10.1.4.    Термохроматография10.2. По принципу разделения и стационарной фазе10.2.1.    Адсорбционная (твердая стационарная фаза)10.2.1.1.    Жидкостно-адсорбционная10.2.1.2.    Ионообменная10.2.1.3.    Газо-адсорбционная
Различие подвижности в электрическом и магнитном поле комплекса вещества с заряженными частицами14. Диэлектрофорез

Таблица 2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Физико-химические свойства веществ, используемые в анализеМетоды определения (измерения)Физико-химические свойства веществ, используемые в анализеМетоды определения (измерения)
ЭкстенсивныесвойстваМасса (вес)Объем1.    Гравиметрия (весовые методы)2.    Волюмометрия2.1.    Газоволюмометрия2.2.    Титриметрия2.2.1.    Нейтрализационный анализ2.2.2.    Редоксиметрия2.2.3.    Комплексометрия, в т. ч. комплексонометрия2.3.Объемная седиментометрияВзаимодействие вещества с лучистой энергиейПоглощение лучистой энергии: рентгеновских лучей, ультрафиолетовых лучей, видимых лучей, инфракрасных лучейРассеяние и отражение светаПреломление световых лучей (показатель преломления) Вращение плоскости поляризованного света19. Адсорбционная спектроскопия (спектрофотометрия)19.1.    Рентгеноспектрофотометрия19.2.    В ультрафиолетовом свете19.3.    В видимом свете19.4.    В инфракрасном свете19.5.    Атомно-адсорбционная спектрофотометрия20.1.    Нефелометрия20.2.    Турбидиметрия21.1.    Рефрактометрия21.2.    Интерферометрия22.    Поляриметрия23.    Электронная парамагнитнорезонансная спектроскопия24.    Ядерная магнитнорезонансная спектроскопия25.    Масс-спектрометрия
МеханическиесвойстваПлотность (уд. вес) Вязкость Осмотическое давление3.    Денсиметрия4.    Вискозиметрия δ. Осмометрия5.1.    Прямая осмометрия5.2.    Криоскопия
ТермическиесвойстваТемпература фазовых превращений (плавления, кипения, замерзания)Теплота реакций (сгорания, нейтрализации)Теплопроводность (газа)6.    Термометрия6.1.    Термометрия6.2.    Термогравиметрия6.3.    Дифференциальный термический анализ7.    Калориметрия8.    ТермокондуктометрияДифракция рентгеновских лучей и электроновЭлектронный парамагнитный резонанс (ЭПР)Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) Отклонение ионизированных молекул электрическим и магнитным полем
ЭлектрическиесвойстваЭлектропроводностьДиэлектрическаяпроницаемостьМагнитная восприимчивостьСила диффузионного тока на электроде при реакции восстановления или окисленияКоличество электричества для реакции на электроде Электродный потенциал9. Кондуктометрия10.    Диэлкометрия11.    Импедансометрия12.    Электроспектроскопия13.    Абсорбционная импедансометрия14.    Магнитометрия15.    Амперометрия16.    Полярография16.1.    При контролируемом напряжении16.2.    При контролируемом токе16.3.    При отслаивании вещества с анода16.4.    Пульсационная17.    Кулонометрия18.    Потенциометрия18.1.    С обычными электродами18.2.    Сион-селективными электродами18.2.1.    Мембрана из специального стекла18.2.2.    Твердая мембрана18.2.2.1.    Гомогенная18.2.2.2.    Гетерогенная18.2.3.    Жидкая мембрана18.2.3.1.    Ион-селективный компонент имеет заряд18.2.3.2.    Ион-селективный компонент нейтрален18.2.4.    Мембрана с закрепленным ферментомИспускание излученияПод воздействием высокой температуры, под воздействием возбуждающего света, теплоты или химической реакции, рентгеновских лучей26. Эмиссионная спектроскопия (спектрофотометрия)26.1.    Фотометрия пламени26.2.    Флюориметрия (измерение люминесценции и хемилюминесценции)26.3.    Лазерная спектроскопия26.4.    Рентгеновская флюориметрия
Ядерные свойстваРадиоактивность27.1.    Нейтронный активационный анализ27.2.    Радиоиндикаторный анализ2 7.3. Метод изотопного разведения 27.4. Сатурационный анализ27.4.1.    Радиоиммунологический анализ27.4.2.    Конкурентное связывание
ХимическиесвойстваСкорость химических i реакций28.1. Кинетические методы

Библиография: Асатиани В. С. Биохимическая фотометрия, М., 1957, библиогр.; он же, Новые методы биохимической фотометрии, М., 1965, библиогр.; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М.

, 1969; Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, под ред. В. В. Меньшикова, М., 1973; Юинг Г. В. Инструментальные методы химического анализа, пер. с англ., М., 1960; Arbeits-methoden der inneren Medizin und ihr verwandter Gebiete, hrsg. v. R.

Emmrich, Bd 5, Lfg 1, Jena, 1969; Automation in analytical chemistry, В. a. o., 1972; Henry R. J. Clinical chemistry, N. Y., 1964, bibliogr.; Homolka J. Klinick6 bio-chemick£ vySetfovaci metody, Praha, 1971, bibliogr.; R e h f e 1 d N. u. R e ίο h e 1 t D.

Analytische und praparative Methoden der klinischen Biochemie, B.,1972; R ichterich R. Klinische Chemie, Basel uv a., 1971.

B. B. Меньшиков.

Источник: https://xn--90aw5c.xn--c1avg/index.php/%D0%91%D0%98%D0%9E%D0%A5%D0%98%D0%9C%D0%98%D0%A7%D0%95%D0%A1%D0%9A%D0%98%D0%95_%D0%9C%D0%95%D0%A2%D0%9E%D0%94%D0%AB_%D0%98%D0%A1%D0%A1%D0%9B%D0%95%D0%94%D0%9E%D0%92%D0%90%D0%9D%D0%98%D0%AF

Методы измерения в клинической биохимии

Методы биохимических исследований

Биохимия:

30.11.2009

Дылдин Д.Р. – директор ООО «Юнимед-Сервис»

Шибанов А.Н. – генеральный директор А/О Юнимед, член правления Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, генеральный секретарь РАМЛД

Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.

В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.

При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.

Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения.

Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа.

Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.

Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения. 

Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.

Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).

Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются.

Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими).

От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.

Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax).

Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу.

Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.

Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата.

В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически.

Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни.

Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.

Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.

Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать.

Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей).

Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.

Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.


Рисунок 1
. Принципиальная схема фотометрического анализа

Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).


Определение по конечной точке

 После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs).

По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается.

Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.


Рисунок 2.

Остановимся на этом моменте подробнее.

При калибровке по стандарту, выполняется замер оптической плотности реакционной смеси, где концентрация искомого вещества заведомо равна нулю (бланк). Затем, измеряется оптическая плотность реакционной смеси, где концентрация искомого вещества известна с высокой точностью (калибратор или, как еще говорят – стандарт), и химическая реакция подошла к концу (т.е.

время инкубации закончилось). Калибратор обычно прилагается к набору реагентов. Допустим, что 250 – это оптическая плотность бланка, 700 – это оптическая плотность стандарта.

 Получив эти величины, мы можем построить график, где на горизонтальной оси – концентрация, а по вертикальной – оптическая плотность, причем оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации.

Factor = сtg a

Рисунок 3.

Источник: https://unimed.ru/biblioteka/biohimiya1/metody-izmereniya-v-klinicheskoj-biohimii.html

Лекция №3. Биохимические методы исследования

Методы биохимических исследований

Для того чтобы получить полное представление о работе того или иного органа тела человека, уже не одно десятилетие успешно применяют метод биохимического анализа крови. Это один из способов лабораторной диагностики, который очень информативен для врача и отличается высокой степенью достоверности.

Биохимический анализ кровине только раскроет полную картину функционирования того или иного органа, но и расскажет, испытывает ли человек недостаток в том или ином микроэлементе или витамине.

Области медицины, которые используют результаты биохимического анализа крови в своей практике, это — гастроэнтерология, урология, терапия, кардиология, гинекология и другие.

Даже если у вас нет никаких проявлений болезни, и вы чувствуете себя совершенно здоровым, биохимический анализ крови поможет установить, какой из органов плохо справляется со своей задачей и работает не так, как положено. Любое изменение в химическом составе крови свидетельствует о неблагополучной ситуации и необходимости срочного вмешательства.

Для того чтобы сделать биохимический анализ крови, у пациента из локтевой вены берется около 5 мл крови. Изучение биохимического анализа крови направлено на выявление ее состава, результаты исследования заносят в специальный бланк.

В немперечислены основные компоненты и их содержание в крови пациента. Врач сравнивает результаты анализа крови с теми цифрами, что являются общепринятыми и эталонными для анализов крови здоровых людей.

Значения биохимических анализов кровимогут разниться в зависимости от пола или возраста больного.

Все показатели химических анализов крови обычно не имеют четких значений, а определяются относительно предельных параметров, т. е. рамок между их минимальной и максимальной величиной.

Очень часто один и тот же анализ крови трактуют по-разному – это связано с тем, что специфика каждой клиники устанавливает для себя критерии, по которым оценивается результат биохимических анализов крови.

Опытный врач легко сопоставит результаты анализа крови и симптоматику заболевания, и на их основании вынесет вердикт.

Биохимический анализ крови вы легко можете сдать в любой клинике города.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

  • Материалом для исследования является венозная кровь, которая берется из локтевой вены.
  • Для исследования следующих параметров кровь забирается в обычную сухую пробирку или в вакуумную пробирку с красной крышкой: АЛТ, АСТ, билирубин общий, билирубин прямой, тимоловая проба, ГГТ, ЩФ, α-амилаза, глюкоза, фруктозамин, ЛДГ, креатинкиназа, триглицериды, α-холестерин, холестерин, β-холестерин, индекс атерогенности, общий белок, альбумин, общий кальций, калий, натрий, хлор, фосфор, магний, железо, ОЖСС, трансферрин, СРБ, ревматоидный фактор, АСЛО, мочевая кислота, мочевина крови, скорость клубочковой фильтрации, креатинин, церулоплазмин, α1-антитрипсин. При исследовании на широкий биохимический профиль количество забираемой крови должно быть не менее 9 мл.
  • На пробирках в обязательном порядке должны указываться идентификационный номер пациента и название медицинского учреждения.Идентификационный номер должен сохраняться в регистрационном журнале учреждения.
  • В лабораторию может отдаваться как цельная кровь, так и отобранная сыворотка. Для отделения сыворотки от форменных элементов необходимо: центрифугировать кровь после образования сгустка при 300g (1500 об/мин) в течение 10 минут, затем отобрать сыворотку в одноразовую пластиковую пробирку типа eppendorf (1,5 мл).
  • Для исследования на гликогемоглобин кровь забирается в вакуумную пробирку с фиолетовой крышкой (с К3ЭДТА).
  • Для исследования на ПТИ, фибриноген, МНО кровь забирается в вакуумную пробирку с синей крышкой (с цитратом натрия).
  • Для некоторых параметров необходимы дополнительные условия:

1. Индекс атерогенности – определяется только при одновременном назначении холестерина и α-холестерина.

2. ОЖСС – определяется только при одновременном назначении железа.

3. Скорость клубочковой фильтрации – только при одновременном назначении креатинина в крови, креатинина в суточной моче с указанием суточного диуреза. Необходимо так же указать пол, возраст и вес.

· Кровь или сыворотка пациента до передачи курьеру должна храниться в холодильнике (+2 – +4?С) или в контейнере с хладогеном. ” Пробирки с кровью отдаются курьеру вместе с направлениями. Номера пробирок должны соответствовать номерам на направлениях.

· Кровь и сыворотка отправляется в лабораторию в день забора крови. До следующего дня хранить кровь или сыворотку нельзя!

При проведении биохимического исследования особое внимание обращают на следующие показатели:

• Белок плазмы крови и его фракции.

• Показатели жирового обмена.

• Билирубин сыворотки крови.

• Небелковые азотистые компоненты крови, такие как остаточный азот, мочевина, креатинин, мочевая кислота, индикан, ферменты сыворотки крови, а также неорганические вещества.

Правильная расшифровка биохимического анализа крови и знание нормальных показателей позволяет очень точно определить нарушения в водно-солевом обмене, дисбаланс микроэлементов, воспалительные процессы и инфекции, а так же состояние различных органов.

Какие же нормальные показатели биохимического анализа крови:

Показатели в норме Возможные патологии
Глюкоза (в крови) Нормальные показатели в крови глюкозы: 14 лет — 3,33 — 5,55 ммоль/л 14 — 60 лет — 3,89 — 5,83 ммоль/л 60 — 70 лет — 4,44 — 6,38 ммоль/л 70 лет — 4,61 — 6,10 ммоль/л Высокий уровень глюкозы указывает на сахарный диабет, опухоли надпочечников, тиреотоксикоз, синдром Кушинга, акромегалия, гигантизм, рак поджелудочной железы, панкреатит, хронические болезни почек и печени, муковисцидоз. Низкое содержание этого показателя бывает при голоданиях и передозировках препарата инсулина,раке поджелудочной, усиленном росте раковых клеток в организме, болезни надпочечников, щитовидки, патологии гипофиза, алкогольных отравлених в тяжкой форме, других отравлениях организма, болезнях кишечника и желудка.
Билирубин общий: Нормальные значения общего билирубина: 3,4 — 17,1 мкмоль/л. Билирубин прямой: Нормальные показатели прямого билирубина в крови: 0 — 7,9 мкмоль/л. Билирубин непрямой: Нормальные значения непрямого билирубина: < 19 мкмоль/л. Билирубин общий — желтый пигмент крови, который образуется в результате распада гемоглобина, миоглобина и цитохромов. Основные причины повышения количества общего билирубина в крови: поражение клеток печени (гепатиты, цирроз), усиленный распад эритроцитов (гемолитические анемии), нарушение оттока желчи (например, желчнокаменная болезнь). Билирубин прямой (билирубин конъюгированный, связанный) — фракция общего билирубина крови. Прямой билирубин повышается при желтухе, развившейся из-за нарушения оттока желчи из печени. Билирубин непрямой (билирубин неконъюгированный, свободный) — разница между показателями общего и прямого билирубина. Этот показатель повышается при усилении распада эритроцитов – при гемолитической анемии, малярии, массивных кровоизлияниях в ткани и т.п.
АсАТ: Нормальные показатели АсАТ:
  • Женщины – до 31 Ед/л
  • Мужчины – до 37 Ед/л.

АлАТ (АЛТ, аланинаминотрансфераза): Нормальные значения АлАТ:

  • женщины – до 34 Ед/л;
  • мужчины – до 45 Ед/л.

 

Ферменты печени и миокарда АЛТ повышается при паренхиматозных заболеваниях печени, особенно при инфекционных гепатитах в инкубационный период, что является важным признаком для ранней диагностики. АСТ находится в большом количестве в мышце сердца и в печени. В данном случае для дифференциальной диагностики используется отношение активности АСТ к АЛТ. Повышается коэффициент выше нормы при поражении мышцы сердца (например, при инфаркте миокарда) за счет повышения активности АСТ. Понижается коэффициент ниже нормы при инфекционном гепатите за счет повышения активности АЛТ.
Гамма-ГТ (гамма-глутамилтрансфераза): Нормальные показатели гамма-ГТ:

  • Мужчины < 55 Ед/л
  • Женщины < 38 Ед/л
фермент, содержащийся преимущественно в клетках печени и поджелудочной железы. Повышение его количества в крови наблюдается при заболеваниях этих органов, а также при длительном приеме алкоголя.
Фосфатаза щелочная: Нормальные значения в крови фосфатазы щелочной: 30-120 Ед/л. фермент, широко распространенный в тканях человека. Наибольшее клиническое значение имеют печеночная и костная формы щелочной фосфатазы, активность которых и определяется в сыворотке крови
Холестерин (холестерол общий): Нормальные показатели в крови холестерина — 3,2-5,6 ммоль/л. основной липид крови, который поступает в организм с пищей, а также, синтезируется клетками печени. Повышенный уровень указывает на развитие атеросклероза сосудов. Болезни сердца.
Липопротеины низкой плотности (ЛПНП): Нормальные значения ЛПНП: 1,71-3,5 ммоль/л. одна из самых атерогенных, «вредных» фракций липидов. ЛПНП очень богаты холестерином и, транспортируя его к клеткам сосудов, задерживаются в них, образуя атеросклеротические бляшки.
Триглицериды: Нормальные показатели триглицеридов: 0,41-1,8 ммоль/л. Триглицериды нейтральные жиры, находящиеся в плазме крови, важный показатель липидного обмена. Используют для анализа при болезнях сердца, инсультах. Как фактор формирования атеросклерозов сосудов и ишемической болезни. Нарушение липидного обмена это не одна из причин, созревания атеросклероза.  
Общий белок: Нормальные значения общего белка: 66-83 г/л. БЕЛОК — показатель, отражающий общее количество белков в крови. Его снижение наблюдается при некоторых болезнях печени и почек, сопровождающихся повышенным выведением белка с мочой. Повышение – при заболеваниях крови и инфекционно-воспалительных процессах. Вследствии низкого уровня белков часто возникают отеки.Причиной снижение белка может быть: вегетарианская диета ;увеличенной потере белка в организме при голодании;патологии формирования белка в организме. Это может быть вследствии:
  • патологий в желудочно-кишечном тракте.
  • при остром и хроническом кровотечении в организме
  • при раковых опухолях

Патологии образования белка также бывают при недостаточности функции печени, при болезнях, таких как, циррозы печени, гепатиты, дистрофия печени. Высокое содержание белка формируется из-за обезвоживания. Случается это при:

  • перегревании человека
  • при ожогах
  • при различных травмах
  • при заболеваниях сопровождающих обезвоживание тела, например холера.
  • миеломной болезни
Альбумин: Нормальные значения альбумина: 35-52 г/л важнейший белок крови, составляющий примерно половину всех сывороточных белков. Уменьшение содержания альбумина может быть также проявлением некоторых болезней почек, печени, кишечника. Повышение альбумина обычно связано с обезвоживанием.
Калий (К+): Нормальные показатели калия: 3,5-5,5 ммоль/л. электролит, содержащийся преимущественно внутри клеток. Влияет на работу многих клеток в организме, особенно нервных и мышечных. Повышение уровня калия является признаком следующих нарушений в организме человека:
  • повреждение клеток
  • обезвоживание
  • шок
  • ацидоз
  • острая почечная недостаточность
  • надпочечниковая недостаточность
  • увеличение поступления солей калия

Обычно калий увеличен вследствие приема противоопухолевых, противовоспалительных препаратов и некоторых иных лекарственных лекарств. Понижение концентрации калия в крови бывает при недостаточном поступлении с пищей, повышении потерь с мочой и калом, при рвоте, поносе, употреблении калий истощающих мочегонных средств, использовании стероидных препаратов, отдельных гормональных нарушениях, внутривенном введении больших объемов жидкости, не содержащей калия.

Натрий (Na+): Нормальные значения натрия:136-145 ммоль/л . электролит, содержащийся преимущественно во внеклеточной жидкости, и в меньшем количестве — внутри клеток. Он отвечает за работу нервной и мышечной ткани, пищеварительных ферментов, кровяное давление, водный обмен.
Хлор (Сl-): Нормальные показатели хлора: 98-107 ммоль/л. один из главных электролитов, который находится в крови в ионизированном состоянии и играет важную роль в поддержании водно-электролитного и кислотно-основного балансов в организме.
Креатинин : Нормальные значения креатинина:

  • мужчины — 62 – 115 мкмоль/л;
  • женщины — 53 — 97 мкмоль/л.
вещество, которое играет важную роль в энергетическом обмене мышечной и других тканей.Используется для диагностики болезни почек, в частности при почечной недостаточности. При острой патологии почек уровень креатинина достигает крайне повышенных значений 0,8-0,9 ммоль/л.
Мочевина: Нормальные показатели в крови мочевины: 2,8-7,2 ммоль/л вещество, которое является конечным продуктом метаболизма белков в организме. Она выводится почками, поэтому определение ее концентрации в крови дает представление о функциональных способностях почек и наиболее широко используется для диагностики почечной патологии. Высокое содержание в крови наблюдается при употреблении мясной пищи и богатой белками, а также при опухолях и воспалениях в организме. Если избыток мочевины долгое время не выводится из организма это свидетельствует о почечной недостаточности. Низкое содержание мочевины — один из признаков печеночной недостаточности у пациента.
Мочевая кислота: Нормальные значения мочевой кислоты:
  • мужчины — 210 — 420 мкмоль/л;
  • женщины — 150 — 350 мкмоль/л.
один из конечных продуктов метаболизма белков в организме. Мочевая кислота полностью выводится почками. Повышение концентрации мочевой кислоты встречается при почечнокаменной болезни, других заболеваниях почек, протекающих с почечной недостаточностью. Повышенное содержание мочевой кислоты в крови отмечают при подагре, а также при инфекциях в организме (пневмонии, тиф, туберкулез), В12-дефицитной анемии, лейкозе крови. Также при заболеваниях печени, остром сахарном диабете, псориазе, экземе, отравлениях химическими соединениями углерода.
С-реактивный белок (СРБ): Нормальные показатели С-реактивного белка: 0 — 5 мг/л. чувствительный элемент крови, быстрее других реагирующий на повреждения тканей. Наличие реактивного белка в сыворотке крови – признак воспалительного процесса, травмы, проникновения в организм чужеродных микроорганизмов – бактерий, паразитов, грибов. Чем острее воспалительный процесс, активнее заболевание, тем выше С-реактивный белок в сыворотке крови.
Железо (сывороточное железо): Нормальные значения сывороточного железа:
  • женщины — 8,95 — 30,43 мкмоль/л;
  • мужчины — 11,64 — 30,43 мкмоль/л
жизненно важный микроэлемент, который входит в состав гемоглобина, участвует в транспорте и депонировании кислорода и играет важную роль в процессах кроветворения. Железодефицитные состояния — одно из наиболее общераспространенных недомоганий человека.При дефиците железа страдает целый организм
Гемоглобин: Норма гемоглобина для мужчин: 130 — 160 г/л, для женщин: 120 — 150 г/л Отклонения от нормы гемоглобина в крови диагностирует анемию.
Фибриноген: Норма — 0.1-0.6 (0.8-1.3) г%; 2-6г/л ;200-400мг%; Высокое содержание фибриногена быает при гломерулонефрите,нефрозе, инфекционных болезнях,беременности.



Источник: https://infopedia.su/1x1cc9.html

Методы биохимических исследований

Методы биохимических исследований

Вбиохимии широко применяют диализ,центрифугирование, оптические методы,различные виды хроматографии и др.

Оптическиеметоды

Воснову абсорбционнойспектроскопии положен принцип измеренияпоглощения света, проходящего сквозьраствор исследуемого вещества, вследствиеего абсорбции.

Измерение спектровосуществляют на специальных спектральныхаппаратах, в которых пробу веществапомещают между источником света ифотоэлементом, регистрирующим свет.Каждое вещество имеет характерный светпоглощения.

Для аналитических целейиспользуют длину волны, соответствующуюмаксимуму поглощения исследуемогосоединения (λmax).

Фотоэлектроколориметрия– это измерение поглощения видимойчасти спектра окрашенными растворами.

Собственноспектрофотомерия – это измерениепоглощения (пропускания) прозрачныхрастворов в ультрафиолетовой, видимойи инфракрасной зонах спектра (220-1100 нм).

Нефелометрия– метод измерения интенсивностирассеянного света.

Кприборы, базирующимся на измерениисветопоглощения веществ, относятсяфотоэлектроколориметры (ФЭК) испектрофотометры (СФ). ФЭК позволяютпроводить измерения поглощения в видимойчасти спектра.

СФ дают возможностьпроводить измерения в широком диапазонедлин волн – от ультрафиолетового доинфракрасного (210-1100 нм) и исследоватьокрашенные и бесцветные растворы вузкой зоне спектра, на участке максимальногопоглощения монохроматического потокасвета.

Воснове абсорбционной спектрофотометриилежат общие принципы способности веществпоглощать световую энергию по закономБугера-Ламберта и Бера: D= kcd;

гдеD– оптическая плотность раствора;

k– молярный коэффициент поглощения(экстинкция),который равен оптической плотности 1 Мраствора при толщине слоя в 10 мм;

с– концентрация раствора, моль/л;

d– толщина слоя жидкости, см.

Электрофорез

Явлениеэлектрофореза – это перемещениезаряженных частиц в электрическом поле.

Поведениечастицы в электрическом поле описываетсятремя основными характеристиками:скоростью движения частицы v,электрокинетическим потенциалом и электрофоретической подвижностью U.

-потенциалпрямо пропорционален свободному (нескомпенсированному ионами среды) зарядучастицы (Q)и обратно пропорционален ее радиусу(r).Скоростьзаряженной частицы прямо пропорциональна-потенциалу.

Электрофоретическая подвижность Uравна отношениюскоростичастицы к напряжению электрическогополя.

где Е–напряженность электрического поля,В/см;

– диэлектрическаяпостоянная среды,

 – вязкость среды.

Наиболеечасто метод используют для аналитическихцелей – для разделения смеси заряженныхвеществ на фракции с последующимкачественным и количественным ихопределением.

Таким способом удаетсяразделить, например, белки сывороткикрови на 5 фракций: альбумин и 4 фракцииглобулинов.

Эту задачу часто решают вклинической биохимии, так как соотношениефракций закономерно изменяется примногих патологических процессах.

Методподразделяется на фронтальныйили свободный электрофорез (электрофорезв жидкой среде) и зональный или электрофорез в поддерживающихсредах.

В качестве поддерживающих средприменяются различные инертные пористыеприродные либо синтетические материалы:бумага, ацетилцеллюлоза, крахмал в видевлажных зерен и в виде геля, гель агаралибо агарозы, полиакриламидныйсинтетический гель – ПААГ.

Задачаподдерживающей среды – стабилизироватьжидкость, уменьшить диффузию, а в рядеслучаев – создать дополнительныймеханизм разделения. Например, в некоторыхвариантах метода разделение поэлектрофоретической подвижности можносочетать с разделением по молекулярноймассе (наилучшим образом это достигаетсяв ПААГ).

Однойиз высокоразрешающих разновидностейметода является диск-электрофорез(от английского«discontinuos»- прерывистый, неоднородный). В этомметоде движение молекул проходит вначалечерез концентрирующий крупнопористыйгель, где разделяемая смесь концентрируетсяблагодаря движению между 2-мя сортамиионов.

Движущиеся впереди пробы ведущиеионы (принадлежат сильному электролиту)и находящиеся позади пробы замыкающиеионы (принадлежат слабому электролиту)создают разную напряженность поля пообе стороны зоны, занятой пробой. Вследствие этого «фронт» пробытормозится, а «тыл», напротив, подгоняется.

Таким путем достигается эффектконцентрирования. Затем проба переходитв разделяющий гель с иным значением рНбуферного раствора.

Вследствие изменениярН (а значит, и степени диссоциациислабого электролита) замыкающие ионыопережают пробу, которая перемещаетсятеперь на фоне замыкающих ионов -оказывается в однородной по рНмелкопористой среде. В этом втором,разделяющем геле происходит обычныйэлектрофорез.

Повышение разрешающейспособности метода достигается за счеттого, что перед разделением пробаконцентрируются в виде очень узкойстартовой зоны, и таким образом удаетсяразделить даже вещества, мало отличающиесядруг от друга по свойствам.

Хроматография

Хроматографическиеметоды основаны на динамическомраз­делении смеси веществ. Общийпринцип хроматографии состоит в том,что непрерывный поток подвижнойфазы, содержащей анализируемый образец,направленно проходит через стационарнуюфазу, которая в зависимости от своейприроды, взаимодействует в различнойстепени с компонентами образца.

Распределениесоединения между двумя несмешивающимисяфазами определяется коэффициентомраспределения,который для каждого конкретного веществав системе из двух фаз при даннойтемпературе постоянен и выражаетсяотношением концентрации вещества вподвижнойфазе к егоконцентрации в стационарнойфазе. Фазыдля хроматографического разделениявыбирают так, чтобы коэффициентыраспределения компонентов смеси в нихбыли различными.

Взависимости от агрегатного состоянияподвижной фазы хроматографическиеметоды делят на газовую и жидкостнуюхроматографию; в зависимости отгеометрической формы стационарной фазы– на колоночную и плоскостную(бумажную или тонкослойную).

Взависимости от механизма разделениявеществ выделяют следующие видыхроматографии:

  • Адсорбционная хроматография основана на различной адсорбируемости компонентов разделяемой смеси на поверхности раздела фаз.

    Эти различия связаны главным образом с различиями в дипольных моментах (в полярности) разделяемых веществ, а также подвижной и неподвижной фаз хроматографической системы. Так, из полярной подвижной фазы на неполярном адсорбенте лучше адсорбируются неполярные вещества.

    Примером неполярного адсорбента может служить активированный уголь, сажа; полярного – окислы металлов, гидроокиси, некоторые соли, силикагель, полисахариды.

  • Абсорбционная или распределительная хроматография основана на различной абсорбируемости (поглощении всем объемом стационарной жидкой фазы, растворимости в ней) компонентов разделяемой смеси. В основе метода также лежит соотношение дипольных моментов разделяемых веществ и компонентов хроматографической системы.

    Примером распределительной хроматографии может служить разделение аминокислот в системе бутанол-вода либо фенол-вода. Стационарная полярная фаза – вода – удерживается инертным пористым твердым телом – бумагой, силикагелем и т.п..

    Бутанол – неполярная подвижная фаза содержит компоненты разделяемой смеси и движется относительно воды, удерживаемой твердой пористой подложкой.

  • Хемосорбционные методы основаны на использовании хемосорбции. Наиболее распространенным из них является ионообменный метод, в котором используются различия в константах диссоциации разделяемых веществ-электролитов.

    Разделяемые вещества в виде катионов или анионов обратимо обмениваются на катионы или анионы, содержащиеся в стационарной твердой фазе (катионите или анионите, соответственно). Подвижная фаза – полярный растворитель (обычно буферный или солевой водный раствор).

    В качестве твердого пористого тела, содержащего прикрепленные к нему обмениваемые ионы, служат природные или синтетические полимеры – ионообменные смолы (целлюлоза, декстран, агароза, полиакриламид, полистирол).

  • Гель-хроматография или молекулярно-ситовая хроматография основана на разделении веществ в соответствии с их размерами (молекулярными массами). В этом методе используются те же пористые тела, что служат основой для ионообменной хроматографии, но без прикрепленных к ним ионогенных групп.

    Материал стационарной фазы представляет собой сферические гранулы определенного размера, внутри которых имеются поры. Размер пор также стандартен и выбирается так, чтобы обеспечить хорошую разрешающую способность метода.

    Наиболее крупные молекулы не могут проникнуть во внутренние мелкие поры и передвигаются только по промежуткам между гранулами. Они идут с наибольшей скоростью.

    Более мелкие частицы движутся с разными скоростями, в зависимости от того, какая доля объема внутренних пор доступна для них в соответствии с их размерами. Медленнее всех движутся самые мелкие молекулы.

  • Аффинная хроматография. Метод основан на специфическом сродстве (affinity) некоторых биологически активных веществ друг к другу. Один из партнеров – аффинант – обездвиживают (иммобилизуют) на твёрдой пористой подложке, вместе с которой он образует стационарную фазу. Второй партнер содержится в подвижной фазе.

    Аффинная хроматография позволяет выделить его из смеси любой степени сложности. Так, при пропускании через крахмал был выделен из панкреатического сока только один из его компонентов – фермент амилаза, для которого крахмал является субстратом.

    Наиболее распространенные пары веществ: фермент и субстрат, фермент и ингибитор, фермент и кофермент, антитело и антиген, рецептор и сигнальная молекула, транспортный белок и транспортируемое им вещество, комплементарные друг другу нуклеотиды.

    В связи с чем аффинная хроматография широко используется для очистки антигенов и антител, гормонов, рецепторов, транспортных белков, ферментов и т.п.

Методцентрифугирования

Разделение иисследование веществ с помощьюцентрифугирования основано на разнойскорости оседания (седиментации) вцентробежном поле частиц, имеющих разнуюплотность, форму или размеры.

Коэффициентседиментации зависит от молекулярноймассы и формы частицы, а также от плотностии вязкости среды выделения, чтоиспользуется для определения молекулярноймассы.

Простейшаязадача центрифугирования заключаетсяв отделении осаждённых веществ отрастворов как этап выполнения аналитическихработ. Например, отделение белков отдругих органических соединений послеосаждения. Подбирая скоростицентрифугирования и определенные средывыделения, можно избирательно осаждатьразные клеточные структуры: ядра,митохондрии, лизосомы, рибосомы,эндоплазматический ретикулум.

Радиоизотопныеметоды

Основаны на способностинестабильных радиоизотопов испускатьчастицы или электромагнитное излучение,которые фиксируются специальнымиметодами.

Основными преимуществамиметодов с применением радиоизотопныхметок являются их чувствительность ивозможность вводить метки в живойорганизм, что позволяет исследоватьметаболические превращения, механизмыи скорости поглощения и переноса веществв интактном организме, возрастбиологических образцов.

Источник: https://studfile.net/preview/5857580/page:4/

Vse-referaty
Добавить комментарий