Протеомика

Протеомика – это… Определение, методы, задачи

Протеомика

Протеомика – функциональная наука, основным предметом изучения которой является протеом. Протеом представляет собой весь набор белков, которые продуцируются или модифицируются организмом или системой.

Протеомика – это наука, изучающая виды белка, а потому она помогла открыть множество новых видов этого соединения – гораздо больше, чем было известно до ее возникновения как науки.

Количество белков, как оказалось, зависит от времени и различных требований или стрессов, которым подвергаются клетки или организмы. Протеомика – это междисциплинарная область, которая в значительной степени предопределена новейшими проектами по изучению генома.

Она охватывает исследование протеомов из общего уровня белкового состава, структуры и активности. Функциональная протеомика часто называется самым важным компонентом функциональной геномики.

Предмет исследования

Дать определение протеомики не так просто, как может показаться на первый взгляд. Эта наука обычно подразумевает крупномасштабный экспериментальный анализ белков и протеомов, но часто используется для изучения возможностей очистки белков.

После геномики и транскриптомики протеомика является следующим шагом в изучении биологических систем.

Она гораздо сложнее, чем геномика, потому что геном организма более или менее постоянен, тогда как протеом отличается от клетки к клетке и время от времени.

Отдельные гены экспрессируются в разных типах клеток, а это означает, что даже основной набор белков, которые продуцируются в клетке, необходимо идентифицировать.

Протеомика изучения структуры белков – направление в биохимии, выделившееся относительно недавно. В прошлом исследования белков проводились с помощью анализа РНК, но оказалось, что структура РНК никак не коррелирует с содержанием белка.

Известно, что мРНК не всегда транслируется в белок, а количество белка, продуцируемого для данного количества мРНК, зависит от того, какой ген транскрибируется, а также от текущего физиологического состояния клетки.

Протеомика – это наука, которая подтверждает наличие белка и обеспечивает прямую оценку присутствующего количества.

Последующие изменения

Мало того, что извлечение белка с мРНК вызывает его повреждение, но, кроме того, многие белки также подвергаются широкому спектру химических модификаций после этого процесса. Многие из этих посттрансляционных модификаций имеют решающее значение для функции белка.

Фосфорилирование

Одной из таких модификаций является фосфорилирование, которое происходит со многими ферментами и структурными белками в процессе клеточной передачи сигналов.

Добавление фосфата к определенным аминокислотам, чаще всего серинам и треонину, опосредуемым серин / треонинаминазами или реже тирозином, опосредованным тирозинкиназами, заставляет молекулу белка стать мишенью для связывания или взаимодействия с различным набором других молекул, которые распознают фосфорилированный домен.

Поскольку фосфорилирование белка является одной из наиболее изученных его модификаций, многие «протеомические» усилия направлены на определение набора фосфорилированных белков в конкретной клетке или тканевом типе при определенных обстоятельствах.

Убиквитинирование

Убиквитин представляет собой небольшой белок, который может быть прикреплен к определенным субстратам ферментами, по-научному называемыми E3 ubiquitin-ligases.

Определение того, какие белки являются поли-убиквитинированными, помогает понять, как регулируется движение молекул этого вещества.

Аналогичным образом, как только исследователь определяет, какие субстраты убиквитированы каждой лигазой, полезно определить набор лигаз, выраженных в конкретном типе клеток.

Дополнительные изменения

Помимо фосфорилирования и убиквитинирования, белки могут быть подвергнуты (в частности) метилированию, ацетилированию, гликозилированию, окислению и нитрозилированию. Некоторые белки подвергаются всем этим изменениям, часто в зависящих от времени комбинациях. Это иллюстрирует потенциальную сложность изучения структуры и функции белка.

Отдельные белки производятся в разных условиях. Клетка может создавать разные наборы белков в разное время или в разных условиях, например, во время развития, клеточной дифференциации, клеточного цикла или канцерогенеза. Дальнейшее увеличение сложности протеома, как уже упоминалось, подразумевает, что большинство белков могут подвергаться широкому спектру посттрансляционных модификаций.

Поэтому исследования в области протеомики – это в перспективе сложная задача, даже если тема изучения этой науки по-прежнему будет ограниченной.

При более амбициозных задачах, например, когда ищут биомаркер для конкретного подтипа рака, ученый-протеомист может выбрать изучение нескольких образцов сыворотки крови у нескольких пациентов с раком, чтобы свести к минимуму смешивающие факторы.

Таким образом, сложные экспериментальные конструкции иногда необходимы для учета динамической сложности протеома.

Отличия от геномики

Протеомика дает разные уровни понимания, чем геномика по многим причинам:

  1. Уровень транскрипции гена дает лишь приблизительную оценку его уровня трансляции в белок. Полученную в изобилии мРНК можно быстро деградировать или трансформировать не самым эффективным образом, в результате чего образуется небольшое количество белка.
  2. Как упомянуто выше, многие белки испытывают посттрансляционные модификации, которые сильно влияют на их функциональность. Например, некоторые белки не активны до тех пор, пока не станут фосфорилированными. Методы, такие как фосфопротеомика и гликопротеомика, используются для изучения посттрансляционных модификаций.
  3. Многие транскрипты приводят к появлению более одного белка, путем альтернативного сращивания или альтернативных посттрансляционных модификаций.
  4. Многие белки образуют комплексы с другими белками или молекулами РНК и действуют только в присутствии этих других молекул. Степень деградации белка играет важную роль в его содержании.

Воспроизводимость

Одним из основных факторов, влияющих на воспроизводимость экспериментов в протеомике, является одновременное элюирование многих других пептидов, которые могут быть измерены масс-спектрометрами. Это приводит к стохастическим различиям между экспериментами из-за зависящего от данных приемов триптических пептидов.

Хотя ранние крупномасштабные анализы протеома дрожжей показали значительную изменчивость в результатах между различными лабораториями, по-видимому, частично из-за технических и экспериментальных различий между ними, воспроизводимость была улучшена в более позднем масс-спектрометрическом анализе, особенно при использовании масс-спектрометров.

Методы исследования

В протеомике существует множество методов изучения белков. Как правило, они могут быть обнаружены с использованием антител (иммунологических анализов) или при помощи масс-спектрометрии. Если анализируется сложный биологический образец, необходимо либо использовать очень специфическое антитело в количественном метоп-блот-анализе (qdb), либо биохимическое разделение.

Обнаружение белка с помощью антител (иммунологических анализов)

Антитела к конкретным белкам или их модифицированным формам использовались в исследованиях биохимии и клеточной биологии. Они относятся к числу наиболее распространенных инструментов, используемых сегодня молекулярными биологами. Существует несколько конкретных методов и протоколов, которые предплагают использование антител для обнаружения белка.

В течение десятилетий фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) использовался для их обнаружения и количественного измерения в образцах биологического вещества.

Вестерн-блот может быть использован для обнаружения и количественного определения отдельных белков, где на начальном этапе сложную органическую смесь разделяют с использованием SDS-PAGE, а затем интересующий белок идентифицируют с использованием антитела.

Модифицированные белки могут быть изучены путем разработки антитела, специфичного для этой модификации.

Например, существуют антитела, которые только распознают определенные белки, когда они являются тирозинфосфорилированными, известными как фосфоспецифические антитела.

Кроме того, существуют антитела, специфичные для других модификаций. Они могут быть использованы для определения набора белков, подвергнувшихся модификации.

Обнаружение заболеваний на молекулярном уровне является движущей силой новой революции в области диагностики и лечения.

Технология цифрового иммуноанализа улучшила чувствительность обнаружения молекул до так называемого аттомолярного диапазона.

Эта возможность дает нам потенциал для открытия новых достижений в области диагностики и терапии, но такие технологии были отнесены к ручным процедурам, которые не очень хорошо подходят для эффективного ежедневного использования.

Хотя обнаружение белка с антителами все еще очень распространено в молекулярной биологии, были разработаны и другие методы, которые не полагаются на антитело.

Эти методы предлагают различные преимущества, например, они часто могут определять последовательность белка или пептида, они могут иметь более высокую пропускную способность, чем антитело, и иногда они могут идентифицировать и количественно определять белки, для которых не существует антител.

Методы протеомики

Одним из самых ранних методов анализа белка была деградация Эдмана (введена в 1967 году), где один пептид подвергается нескольким стадиям химического разложения, чтобы определить его последовательность. Эти методы в основном были вытеснены технологиями, которые обеспечивают более высокую пропускную способность. От методов зависят и различные направления протеомики.

Основные методы разделения

Для анализа сложных биологических образцов требуется снижение их сложности. Это можно выполнить сделать с помощью одномерного или двухмерного разделения. Совсем недавно были разработаны онлайн методы, в которых индивидуальные пептиды были разделены с использованием хроматографии с обращенной фазой, а затем непосредственно ионизированы с использованием метода ESI.

Гибридные технологии

Существует несколько гибридных технологий, которые используют очистку отдельных аналитов на основе антител, а затем проводят масс-спектрометрический анализ для их идентификации и количественной оценки.

Примерами этих методов являются метод MSIA (масс-спектрометрический иммуноанализ), разработанный Рэндалом Нельсоном в 1995 году, и метод SISCAPA (стабильный изотопный стандартный захват с антипептидными антителами), введенный Ли Андерсоном в 2004 году.

Сравнительный протеомический анализ может выявить роль белков в сложных биологических системах, включая размножение.

Например, лечение инсектицидом триазофосом приводит к увеличению содержания коричневых саженцев (Nolaparvata lugens (Stål)) – мужских вспомогательных железных белков (Acps), которые могут быть переданы самкам посредством спаривания, что приводит к увеличению фертильности (т.е. плодовитости) женщин.

Чтобы выявить изменения в типах белков вспомогательных желез (Acps) и репродуктивных белков, полученных от самцов кузнечиков, исследователи провели сравнительный протеомический анализ спящих самцов вида N. lugens. Результаты показали, что эти белки участвуют в репродуктивном процессе взрослых самок и самцов кузнечиков N. lugens.

Высокопроизводительные протеомические технологии

Протеомика – это наука, которая неуклонно набирала обороты в течение последнего десятилетия. Многие из подходов, разработанных этой наукой, абсолютно революционны, некоторые же основываются на старых научных методах. Методы на основе масс-спектрометрии и микроячейки являются наиболее распространенными технологиями для крупномасштабного изучения белков.

Масс-спектрометрия и профилирование

В настоящее время для профилирования белка используются два метода масс-спектрометрии.

Более известный и широко распространенный метод использует двумерный электрофорез с высоким разрешением для разделения белков из разных образцов параллельно с последующим отбором и окрашиванием дифференцированных экспрессированных белков, которые должны быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии.

Несмотря на достижения в 2DE и общей проработанности этого метода, он также имеет свои пределы. Основной проблемой является неспособность идентифицировать все белки в образце, учитывая их вариативность и прочие уникальные свойства.

Второй количественный подход использует стабильные метки изотопа для дифференцированных меток белков из двух различных сложных смесей. Здесь белки в сложной смеси сперва помечаются изотопами, а затем расщепляются с получением меченых пептидов.

Затем меченые смеси объединяют, причем пептиды разделяют многомерной жидкостной хроматографией и анализируют с помощью тандемной масс-спектрометрии. Изотопно-кодированные метки (ICAT) представляют собой широко используемые изотопные метки.

В этом научном методе цистеиновые остатки белков ковалентно присоединяются к реагенту ICAT, тем самым снижая сложность смесей, исключающих остатки, отличные от цистеина.

Протеомика, геномика, метаболомика – новые направления в биологии, отличающиеся сложностью и инновационностью. Далеко не каждому под силу их изучение.

Источник: https://FB.ru/article/426878/proteomika---eto-opredelenie-metodyi-zadachi

Основы протеомики и протеомного картирования

Протеомика

Описание: В настоящее время на уровне академических центров различных НИИ России стран СНГ Западной Европы США и Канады развиваются и внедряются в клинику результаты работы научных технологических платформ для биомедицинских и фармацевтических исследований.

Если геномная карта человека одинакова по сути дела для всех клеток человека это 23 хромосомы с одним и тем же набором генов – исключение составляют 14 половые клетки то в случае протеомной карты человека говорить об общности ее совершенно бессмысленно: каждая клетка каждая ткань каждая…

Дата добавления: 2015-09-04

Размер файла: 128.1 KB

Работу скачали: 32 чел.

Поделитесь работой в социальных сетях

Если эта работа Вам не подошла внизу страницы есть список похожих работ. Так же Вы можете воспользоваться кнопкой поиск

СОДЕРЖАНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………3

1 ПОНЯТИЯ, ПРИНЦИПЫ И НАПРАВЛЕНИЯ ПРОТЕОМИКИ..5

2 ПРОТЕОМНОЕ КАРТИРОВАНИЕ………………………………….7

3 МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЙ ПОДХОД В ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИНОВАЦИОННЫХ ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ………………12

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………….15

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………17

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время происходит революция в представлениях об этиологии, патогенезе и терапии болезней человека, что связано с достижениями в области молекулярной биологии и генетики, молекулярной медицины и фармакологии [1, 6].

Достигнуты серьезные успехи в понимании структуры и функции ДНК, РНК, белков, репликации и функционировании генома, обратной транскрипции, модификации, репарации и рекомбинации ДНК, транскрипции и трансляции мРНК в клетках про- и эукариот.

Многочисленные исследования на основе новых биоаналитических методов прояснили основные пути регуляции экспрессии генов. Подробно изучены технологии рекомбинантных ДНК.

Мощное развитие в настоящее время получило изучение физико-химических основ развития наследственных и социально-значимых болезней человека (атеросклероз, онкопатологии, сахарный диабет, внутриклеточные инфекции, нейродегенеративные болезни и т.д.).

В постгеномную эру остро встает вопрос о практической реализации фундаментальных разработок в области молекулярной биологии, медицины и фармакологии.

При этом отражением функционирования генома являются постгеномные события, связанные с синтезом многочисленных белков, исследованию которых сейчас уделяется особое внимание в рамках отдельного научного направления – протеомики.

Развитие протеомных исследований невозможно без построения алгоритмов и методов анализа, создания базы данных, позволяющих выяснять механизм функционирования биологических текстов и разрабатывать целенаправленные фармакологические воздействия (биотрансформатика).

Связанные проблемы геномики и протеомики, фармакогеномики и биотрансформатики реализуются на основе уникальных методологических решений и технологических платформ.

В настоящее время на уровне академических центров, различных НИИ России, стран СНГ, Западной Европы, США и Канады развиваются и внедряются в клинику результаты работы научных технологических платформ для биомедицинских и фармацевтических исследований.

Цель практики – изучить основы протеомики и протеомного картирования

    Задача практики – закрепление и углубление теоретических знаний, полученных в процессе обучения; освоить методы работы со специальной литературой; собрать  конкретные материалы в соответствии с рекомендованными вопросами; оформить результаты, полученные в ходе прохождение практики.

1 ПОНЯТИЯ, ПРИНЦИПЫ И НАПРАВЛЕНИЯ ПРОТЕОМИКИ

Начало XXI века ознаменовано началом эры протеомики. Термин этот происходит от двух других хорошо известных в биохимии понятий: «PROTEins» и «genОМe» и впервые был использован в 1995 г. [7].

Конечно, геномика не исчезнет, она будет развиваться с той же самой, а может даже большей скоростью, но ясно, что центр постгеномных исследований будет перенесен в область инвентеризации и выяснения протеомной карты человека.

На первый взгляд, задача кажется совершенно не решаемой.

Если геномная карта человека одинакова, по сути дела, для всех клеток человека (это 23 хромосомы с одним и тем же набором генов – исключение составляют 14 половые клетки), то в случае протеомной карты человека говорить об общности ее совершенно бессмысленно: каждая клетка, каждая ткань, каждая биологическая жидкость должна иметь собственную протеомную карту. Несмотря на то, что в каждой клетке может быть около 100 000 функционирующих генов, многочисленные реакции модификации могут увеличить число белков в клетке до 10 – 20 миллионов [2].

В этой связи в настоящее время существует два определения протеомики: узкое, которое можно назвать структурной протеомикой, и более широкое, которое включает и структурную, и функциональную части протеомики.

В узком смысле этого слова протеомикой является наука, занимающаяся инвентаризацией белков с помощью комбинированного использования методов: двумерного электрофореза (2D-электрофорез), масс-спектрометрического (МС) анализа молекулярной массы и последовательности разделенных электрофорезом белков биологического материала с последующим анализом полученных результатов методами биоинформатики. По сути дела, структурная протеомика – это комбинация 2D-электрофореза, масс-спектрометрии и биоинформатики. И если разрешающие возможности двумерного электрофореза известны давно, с первой работы O’Farrell в 1975 г., то возможности МС анализа очень быстро определять молекулярную массу и последовательность полипептидных цепей стали ясны только в самое последнее время. Развивались они настолько быстро, что сейчас некоторыми фирмами созданы уже полностью автоматизированные системы для определения молекулярной массы и последовательности белков, работающие на фентомолярном и атомомолярном уровнях концентрации [7, 8, 10]. С помощью комбинации этих методов можно создать протеомную карту любого биологического материала, которая представляет собой фенотипическое проявление генома клетки, ткани или даже целого органа. В более широком смысле термины протеомный анализ, или протеомика могут быть использованы не только для инвентаризации белков биологического объекта, но и для контроля обратимой посттрансляционной модификации (ПТМ) белков специфическими ферментами, как-то: фосфорилирование, гликозилирование, ацилирование, френилирование, сцльфирование и т.д. [1].

В настоящее время уже более 300 различных типов посттрансляционной модификации охарактеризовано с помощью протеомики [9].

Интенсивное развитие МС-анализа способствовало появлению за последние 5 – 7 лет целой группы направлений протеомных исследований ( рис. 1), большая часть которых имеет биомедицинскую направленность, однако, фундаментальная основа на  сегодняшний день, по-прежнему, сохраняется за структурной и функциональной протеомикой.

Политика большинства стран Евросоюза, России и стран СНГ в той или иной степени связана с естественным стремлением населения жить в соответствии с мировыми стандартами качества.

Такие термины как «экологически чистый район» или «экологически чистый продукт», а также всевозможные слова с приставкой «евро-», прочно вошедшие в обиход, к сожалению, в большинстве случаев, не имеют фактического пополнения.

Вместе с тем, желанные стандарты качества жизни, установленные во многих странах, являются результатом пр отекания сложных процессов, затрагивающих культурные, социальные и правовые аспекты развития этих государств.  

Рисунок 1 – Современные направления протеомного анализа.

2 ПРОТЕОМНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

«В мире не существует двух индивидуумов с абсолютно одинаковым метаболизмом. Индивидуальные различия активности ферментов в печени могут быть причиной различий в ответной реакции пациентов на лекарство” А Гаррод.

Важность этих слов, принадлежащих, сложно переоценить в свете последних достижений молекулярной медицины. Прочтение геномов ряда организмов, и прежде всего человека, ознаменовало начало эры постгеномных технологий.

Существенное влияние они оказали на медицину, позволив систематически анализировать молекулярные механизмы зарождения и развития заболевания. Знание этих механизмов позволяет подойти к качественно новому пониманию вопросов, связанных с профилактикой, диагностикой и лечением заболеваний.

Пожалуй, впервые за всю свою историю медицина получила шанс приблизиться к статусу точной науки, миновав описательную практику анализа патологических процессов, бытовавшую в течение столетий.

Протеомная карта заболевания – это понимание развития клинической картины заболевания в виде количественных и качественных нарушений на геномном, транскрипционном, трансляционном и посттрансялционном уровнях функционирования организма, т.е. на уровне нарушений в составе и взаимодействии генов в ДНК, РНК, белков, липидов, углеводов, а также на уровне образующихся в клетке и взаимодействующих между собой метаболитов.[3]

Важно подчеркнуть, что наличие подобных нарушений часто указывает лишь на вероятность развития патологии, следовательно можно, повлияв на факторы внешней среды, снизить вероятность развития заболевания, если провести соответствующие индивидуальные профилактические мероприятия.

Большинство заболеваний, таких как псориаз, шизофрения, диабет, обусловлены комбинацией малоэффективных генных вариантов, другими словами, обусловлены не единичным нарушениями, а их набором, локализованным в различных генах.

При наличии четкой взаимосвязи между дефектом одного гена и развитием патологии можно говорить о ее наследственном характере.

Однако на долю наследственных приходится лишь 2-5% всех заболеваний, остальные связаны с нарушением целого ансамбля генов, а значит, зависят от индивидуального профиля многих однонуклеотидных замен и/или нарушения экспрессии группы генов.

Протеомная диагностическая карта: включает SNP, ассоциированные с заболеваниями и SNP, ответственные за фармакокинетику и фармакодинамику лекарств, она формируется на основе знаний геномики, протеомики, липидомики, метаболомики, селломики, интерактомики и с применением современных методов полимеразной цепной реакции, хромато-масс-спектрометрии, современных видов микроскопии, микрофлюидных и нанотехнологических решений для аналитических работ.

Подобно тому, как сейчас гражданский паспорт служит документом, удостоверяющим личность, протеомная диагностическая карта, кроме идентификации личности, может предназначаться и для выбора индивидуумом соответствующего образа жизни. На его основе можно определять персонифицированное лечение, воплощая в жизнь золотой стандарт современной медицины: каждому больному – свое лекарство в нужное время и в нужной дозе.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики “молчащих раков”, не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани.

Однако с точки зрения диагностики подход абсолютно неприемлем, поскольку трудно предположить человека, который в рамках плановой диспансеризации соглашается на манипуляции, по сложности и болезненности приближающиеся к хирургической операции.

Значит, единственным наиболее доступным для диагностики биологическим образцом была и будет протеомное исследование крови.

В глобальном масштабе протеомика занимается инвентаризацией всех белков организма. Медицинский аспект проблемы – установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее.

Дело в том, что белков намного больше, чем генов. Число последних оценивается в 30-40 тыс., однако каждый ген может считываться во множестве (до 200) альтернативных вариантов, а значит, белков может быть значительно больше – до 6-8 млн. в одной клетке.

Причем конкретный белок может быть экспрессирован как в виде единичных молекулярных копий, так и в огромном количестве – налицо широкий диапазон концентраций белков в клетке и биологических жидкостях.

Можно возразить, что похожая ситуация складывается и при анализе ДНК, но в отличие от ДНК белки невозможно наработать в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

А ведь именно ПЦР – основа всех методов работы с генетическим материалом, поскольку позволяет избирательно поднять концентрацию определенной молекулы ДНК до уровня, который может быть зарегистрирован приборами. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельны молекулы. [5]

Существует международный проект “Протеом человека” (аналог проекта “Геном человека”) который планирует конструирование протеомной карты всех белков человека.

Первоочередные задачи проекта “Протеом человека” – составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга, а также проведение антигенного картирования генома. Кроме того, специальный комитет в составе проекта рассматривает новые технологические инициативы.

Российский центр проекта принимает участие в разработке протеомной карты плазмы крови и печени, активно развивает новые подходы в области нанотехнологий.

Схема проведения протеомного анализа проста и основана на достижениях современной масс-спектрометрии. Образец, например плазма крови, отбирается у пациента в количестве чуть более 1 мл.. Очевидно, что в плазме крови присутствует множество различных белков.

Разделение белков проводится методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна.

Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен.

Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью масс-спектрометрии.

Протеомный анализ сопряжен с проведением ряда трудоемких рутинных процедур, связанных с тем, что число анализируемых белков велико, а для статистической значимости результата требуется обработать большое количество образцов в соответствии со стандартным протоколом.

Снятые масс-спектры передаются в программу идентификации белков.

Профиль масс, полученный на масс-спектрометре, соответствующий пептидным фрагментам белка, позволяет однозначно его идентифицировать, проведя поиск соответствия с теоретическими профилями, построенными по белкам человеческого генома через специализированные компьютерные базы данных в сети Интернет в онлайн-режиме.

Постгеномная эра открывает широкие перспективы перед российскими учеными – в исследованиях по данному направлению сейчас участвует около десяти научно-исследовательских институтов РАН, РАМН, Минздрава России, Минпромнауки России и МГУ, которые располагают мощной аппаратной базой с квалифицированным техническим персоналом и значит есть потенциал для дальнейшего развития.

Для врача молекулярная карта заболевания – это ключ к точному диагнозу, прогнозу и целенаправленной терапии болезни.

Для исследователя молекулярная карта заболевания – базис для новых открытий.

Рисунок 2 – Молекулярная (протеомная) карта и терапия человека

3 МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЙ ПОДХОД В ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИНОВАЦИОННЫХ ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Передовые методы медицинской диагностики, стоящие на стыке таких наук, как медицина, химия, физика и биология, требуют системного подхода к информационному обеспечению, которое в данном случае должно обеспечивать получение, хранение, обработку м анализ результатов исследований.

Междисциплинарная аналитическая лаборатория, имеющая уникальную базу высокотехнологичного медицинского диагностического оборудования, предполагает разработку новых подходов к еѐ информационному обеспечению.

Консультативно-диагностическая база междисциплинарной лаборатории (центра) включает 6 научных блоков:

– Протеомные и фармакопротеомные исследования биологических жидкостей и тканей организма человека;  

– Исследование индивидуальной чувствительности к лекарственным средствам;

– Исследование биоэквивалентности лекарственных средств;

– Разработка и клинические испытания лекарственных средств (I фаза);

– Информационные стандарты лекарственных средств;

–  Фармакоэпидемиологические исследования и регистрация ПЭ при применении лекарственных средств.

Консультативно-диагностическая база объединяет 6 подразделений лабораторных методов, оснащенных передовым, высокотехнологическим оборудованием:  

– Подразделение ВЭЖХ/МС;  

– Подразделение новых электрофоретических методов исследования; Подразделение ПЦР;

– Подразделение спектрофотометрических методов исследования;  Подразделение MALDI-TOF-MC;  

– Подразделение иммунохимических методов исследования.

Результаты работы всех вышеперечисленных научных блоков и подразделений лаборатории внедряются на уровне консультативного подразделения по клинической фармакологии [4].

Информационную платформу для биомедицинской лаборатории можно представить в виде схемы, объединяющей три блока: эпидемиология и фармакоэпидемиология, молекулярные исследования и базы данных.

Получая большое количество клинической информации и данные эпидемиологических исследований в медицине с помощью высокотехнологичных методов исследования, анализа и обработки их результатов, идентификации полученной информации, формируются базы данных, которые затем посредством информационных технологий применяются во всех областях медицинской деятельности и способствуют решению следующих задач:

–  развитию генодиагностики и генотерапии;

– формированию медико-генетических методов исследования на этапе первичной медицинской помощи;

–  развитию фармакогеномных принципов диагностики и терапии при назначении лекарств;

– развитию исследований фармацевтической эквивалентности и биоэквивалентности лекарственных средств;  созданию банка данных генетических полиморфизмов и протеомных паттернов заболеваний у здоровых лиц и пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время прогресс в биомедицине обусловлен появлением новых электрофоретических методов исследования, методов ПЦР, ВЭЖХ и МС.

Их эффективное применение связано с усовершенствованием способов первичной подготовки биологических образцов для исследования и развитием клеточных технологий.

Соединение возможностей этих методов способствует созданию единых технологических платформ для реализации программ фундаментальных и прикладных исследований в области биомедицины, фармакологии и фармации.

Развитие новых технологических платформ для биомедицинских и фармацевтических исследований происходит на основе нанотехнологических решений.

Открытия в области расшифровки генома человека, геномов патогенных микроорганизмов, а также интересные результаты протеомных исследований биологических жидкостей и тканей организма человека способствуют появлению новых терапевтических агентов для лечения многих социально значимых заболеваний. Мощный потенциал открытий в области геномики, протеомики, метаболомики для разработки генотерапии и новых лекарственных препаратов можно реализовать в полной мере на основе новых технологических платформ и с учетом современных стандартов их проведения.

Важной задачей является создание полноценного биоинформационного ресурса, который станет мощной базой для планирования новых экспериментальных разработок, для интерпретации новых результатов геномных, протеомных исследований, а также для выполнения работ по предиктивной фармакологии. Будущее биоинформатики связано с развитием экспериментальной геномики для пациентов с разработкой типичного сценария развития организма человека, начиная с постнатального периода, что должно произвести революцию в медицине и здравоохранении.

Передовые методы биомедицинской диагностики, стоящие на стыке таких наук, как медицина, физика и биология, требуют системного подхода к информационному обеспечению, которое в данном случае должно способствовать получению, хранению, обработке, анализу и обмену результатами исследований в рамках выполнения многоцентровых программ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика – науки о жизни XXI столетия//Вопр. мед. химии. 2000. № 1. С. 13 – 18.

2. Арчаков А.И. Что за геномика? – Протеомика//Вопр. мед. химии. 2000. № 1. С. 19 – 24.

3. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. – СПб.: Спец. лит, 1997. – 287 с.

4. Горшкова Ю.В., Трегубов А.В. Информационные технологии в лаборатории прикладной фармакокинетики//Проблемы стандапртизации в здавоохранении. 2005. № 11. С. 129 – 132.

5. Ивахно С., Карнелюк А. Количественная протеомика и еѐ применение в системной биологии//Биохимия. 2006. Т. 71. № 10. С. 1312 – 1327.

6. Сарвилина И.В., Каркищенко В.Н., Горшкова Ю.В. Междисциплинарные исследования в медицине. – М.: Техносфера, 2007. – С. 15 – 56.

7. Blackstone N.B., Green D.R. The evolution of mechanism of cell suicid//Bioessays. 1999. Vol. 21. № 1. pp. 84 –88.

8. Fiser A. Protein Structure modeling in proteomics era// Expert Rev. Proteomics. 204. Vol. 1. № 1. pp. 97 – 110.

9. Gerber S.A., Rush J., Stemman O. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS//PNAS. USA. 2003. Vol. 100. № 12. pp. 6940 – 6945.

10. Lander E.S. Array of Hope//Nature Genet. 1999. Vol. 21. pp. 3 – 4.

PAGE   \* MERGEFORMAT 2

Источник: http://refleader.ru/jgebewjgeotrujg.html

Протеомика – высокотехнологичная «рыбалка»

Протеомика
: 11 Май 2010 , Академия обществу , том 32, №2

Мы живем в эпоху, которая регулярно обогащает язык массой новых слов, терминов и понятий. Области знания и информация, наполняющая их, множатся быстрее, чем возможности человека позволяют осознать этот процесс.

«Протеомика» – новое направление науки, появившееся совсем недавно. Объектом ее изучения являются белки – «рабочие лошадки» любой клетки.

Интерес к этим соединениям вызван не только их огромной ролью в функционировании живых организмов, но и тем, что они могут служить мишенями при создании новых лекарств

Слово «протеин», которым в научной литературе принято обозначать белок (высокомолекулярное органическое соединение, представляющее собой цепочку аминокислот), является производным от греческого proteios – «первоначальный». Его этимология точно описывает роль белков в поддержании жизни клетки любого организма – от бактерии до человека.

А вот термин «протеом» знаком, пожалуй, только специалистам. Интересно, что его придумал в 1994 г. австралийский студент М.

Уилкинс, пытаясь в своей дипломной работе найти короткое название полному набору человеческих белков вместо неуклюжего словосочетания «все белки, экспрессируемые геномом».

Уже на следующий год в научной печати появился термин «proteomics» (протеомика), обозначивший новое направление в молекулярной биологии (Wasinger et al., 1995).

Следует отметить, что само предложение «создать молекулярный белковый атлас человека» было озвучено еще около тридцати лет назад (Anderson, 1985). Но в то время оно было, скорее, пожеланием, технологически невыполнимым.

Что же изменилось за прошедшие десятилетия? Во-первых, была успешно реализована программа по геномике, включающая разработку технологий быстрого секвенирования ДНК, создание баз данных нуклеотидных последовательностей.

Вторая предпосылка связана со взрывным развитием инструментальных методов: масс-спектрометрии белков и пептидов (небольших цепочек аминокислот), а также электрофореза и хроматографии, использующихся для разделения органических молекул.

Эти факторы сделали возможным появление новой «высокотехнологичной» биологической дисциплины. 

Белковое изобилие

В отличие от геномов, протеомы, т. е. полные наборы белков клетки, представлены активным набором молекул, которые постоянно модифицируются. При этом, если биохимия имеет дело с отдельными выделенными молекулами, то в случае с протеомом мы имеем дело с огромным молекулярным пулом (уместно провести аналогию с рыбой, пойманной на удочку, и рыбным изобилием принесенным неводом). 

Из этих положений вытекают цели и задачи науки протеомики. Прежде всего, эта дисциплина отвечает за белковую «систематику» – инвентаризацию всех белков, закодированных в геноме определенного организма, которая предполагает также и построение молекулярных белковых атласов отдельных клеток, органов и тканей.

Однако более интересна и намного более существенна задача (назовем ее «физиологической»), которая заключается в определении принципов взаимодей­ствия между белками, а также в установлении закономерно­стей регуляции их работы при так называемой пост-трансляционной модификации (изменении) белков. Это важно для поиска новых маркеров патологических процессов (болезней) в организме человека.

Дело в том, что пост-трансляционная модификация белков происходит в клетке уже после их синтеза в ответ на какое-либо внешнее возмущение или болезнь. В результате свойства белков могут быстро измениться, что влияет на скорость их синтеза и деградации.

В итоге результат таких процессов отразится на общем профиле белков. Изучая его, можно обнаружить белки, «производство» которых в состоянии болезни отличается от «здоровой нормы».

Такие белки могут использоваться в диагностических целях в качестве биомаркеров того или иного заболевания.

Функциональная, структурная и медицинская

Протеомика – наука молодая, но исследования в этой области уже имеют хорошую организационную поддержку. В 2001 г. была основана «Human Proteome Organisation» (HUPO) – международная организация, которая объединяет и направляет усилия ученых.

Протеомика является классическим образцом междисциплинарной науки: она объединяет биологию, химию, компьютерное моделирование, сложную инструментальную технику

На официальной странице HUPO подробно изложены основные направления исследований, перечень которых может многое сказать даже неспециалисту: протеом человека, протеомика мозга, изучение антител, болезни, вызванные нарушениями метаболизма сахаров, протеомика сердечно-сосудистых заболеваний, протеомика стволовых клеток, определение биомаркеров заболеваний, изучение заболеваний человека на мышиных моделях и т. д.

Методологически в протеомике выделяют несколько направлений, главными среди которых являются функциональная, структурная и медицинская (клиническая) протеомика.

О целях функциональной протеомики уже упоминалось выше. Это получение информации о межбелковых взаимодействиях и их влиянии на экспрессию и модуляцию активности генов, а также пост-трансляционную модификацию белков в составе белковых комплексов.

Структурная протеомика, несмотря на то что является классическим направлением исследования белков, тем не менее, продолжает активно развиваться вследствие усовершенствования аналитических методов, таких как новые варианты ЯМР-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и масс-спектрометрии.

КАК МОЛЕКУЛЫ НАУЧИЛИСЬ «ЛЕТАТЬ» Современные масс-спектрометрические методы – инструментальная основа протеомики, метаболомики, фармакокинетики и других «-омик».
Что же измеряет масс-спектрометр? Строго говоря, он детектирует не массу молекулы, а соотношение m/z (соотношение массы иона к его заряду). В масс-спектрометре зачастую одни и те же молекулы могут иметь различные заряды и, соответственно, детектироваться в разное время. Понятно, что не имеющие заряда молекулы (нейтральные) не взаимодействуют с электрическим и (или) магнитным полем и для масс-спектрометра невидимы. Вся история этой молодой науки пестрит именами Нобелевских лауреатов. Создателем первого масс-спектрометра заслуженно считают профессора Кембриджского университета Дж. Томпсона (Нобелевская премия по физике 1906 г.), который еще в самом начале XX в. века наблюдал изменения в движении ионов под действием электромагнитного поля. Основываясь на этих наблюдениях, он создал «параболический спектрограф», в котором молекулярные ионы двигались в электрическом поле по параболическим траекториям и детектировались по свечению люминесцентного экрана. Эта работа была развита и усовершенствована коллегой Томпсона профессором Ф. Астоном, который за создание масс-спектрографа был удостоен Нобелевской премии по химии в 1922 г.
В это же время профессор Чикагского университета А. Демпстер работал над повышением эффективности ионизации молекул в масс-спектрометре. В 1918 г. он создал масс-спектрометр, в котором молекулы ионизировались под действием направленного потока электронов. Этот метод до настоящего времени является основным для ионизации небольших, легко летучих молекул. Сам же автор использовал прибор для определения изотопного состава элементов. Став полноправным участником «ядерной гонки», он в 1935 г. открыл изотоп урана 235U. Его последователь – профессор Университета Миннесоты А. Ниер стал одним из ключевых участников Манхэттенского проекта: первая атомная бомба была создана из 235U, выделенного Ниером с использованием масс-спектрометра. Развитие и совершенствование методов разделения-идентификации молекулярных ионов велось в направлении создания физических моделей, позволяющих дискриминировать ионы по их характеристикам. Самый очевидный способ – позволить ионам лететь в вакууме и разделяться по скоростям, как производные массы молекулы. Так, в 1946 г. профессор Университета Пенсильвании У. Стефенс предложил время-пролетную масс-спектрометрию. Этот метод основан на том, что все ионы ускоряются электрическим полем и получают одинаковую кинетическую энергию. Скорость же каждого из них зависит от соотношения m/z, что позволяет легко их определять. Альтернативный метод разделения молекулярных ионов в середине 1950-х гг. был предложен профессором Боннского университета В. Паулем. Он разработал метод разделения ионов в переменном электрическом поле, положив начало другому типу масс-спектрометров – ионной ловушке. Квадрупольная ловушка Пауля использует для удержания (разделения) ионов постоянные и переменные (радиочастотные) электрические поля. Хотя точность такого метода по сравнению с время-пролетным масс-спектрометром существенно ниже, он выигрывает в скорости сканирования и ширине динамического диапазона. Поэтому ионные ловушки являются идеальными детекторами для анализа в метаболомике, фармакологии, экологических исследованиях, а их создатель также удостоен Нобелевской премии по физике в 1989 г. (совместно с Х. Демельтом).

***

Масс-спектромер, основы конструкции которого были заложены в 20-х годах прошлого века, успешно используется и в настоящее время. Этот прекрасный лабораторный инструмент, способный очень точно характеризовать как химические элементы, так и небольшие органические молекулы, был и остается неизменным и безотказным помощником химиков-синтетиков.
С другой стороны, с помощью традиционных масс-спектрометров оказалось невозможным проводить анализ биологических макромолекул, поскольку биополимеры невозможно ионизовать и перевести в газообразное состояние нагреванием либо облучением пучков электронов. (Почти каждый из нас убедился в справедливости этого утверждения на своем опыте: яичница, забытая на плите, пригорает к сковородке, а не испаряется.) Широкое использование масс-спектрометрии в изучении структуры и функций белков и пептидов стало возможным лишь благодаря технологическому прорыву, случившемуся в 1980-х гг., когда были разработаны новые, подходящие для биомолекул методы ионизации. В 1983 г. команда профессора Йельского университета Дж. Фенна предложила метод ионизации электроспреем, в котором образование ионов достигалось путем распыления раствора образца при прохождении его через капилляр, на который подается высокое напряжение. В это же время немецкая команда Ф. Хиленкампа предложила метод ионизации органических молекул путем облучения их высушенных образцов ультрафиолетовым лазером. При этом молекулы испарялись и ионизировались вместе с твердым летучим органическим веществом – матрицей. Это было рождение, пожалуй, самого популярного и востребованного в настоящее время метода биологической масс-спектрометрии – MALDI («Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization»). Выбор вещества матрицы и подбор оптимального соотношения вещество/матрица обусловливает чувствительность метода за счет максимально эффективного перевода исследуемого вещества в газообразную фазу. Уже через три года после публикации Хиленкампа сотрудник японской компании «Shimadzu» К. Танака предложил готовое решение для масс-спектрометрии белков массой до 100 кДа – время-пролетный MALDI масс-спектрометр. Справедливости ради нужно отметить, что используемые в нем матрицы были жидкими: белки растворялись в глицерине, в котором были взвешены микрочастицы металлического кобальта. Эти работы отмечены Нобелевским комитетом в 2002 г.: Фенн и Танака разделили премию по химии за развитие мягких методов ионизации биомолекул в масс-спектрометрии.

***

В современных спектрометрах распространенным анализатором для MALDI является время-пролетный масс-спектрометр. Молекулярные ионы движутся в вакуумированной трубе, и детектора они достигают в порядке увеличения своей массы. Эффективность получения (регистрации) ионов в MALDI масс-спектрометрии зависит от многих параметров: способа приготовления и очистки образца; количественного соотношения матрицы к анализируемому веществу и правильного выбора материала подложки. Важными условиями получения устойчивого сигнала являются мощность лазерного излучения, выбор «горячей точки» на образце, давление в области ионизации. Для масс-спектрометров с электроспрейным ионным источником в качестве анализаторов наиболее часто используют ионные ловушки. В настоящее время сочетание квадруполя с электроспрейным источником ионов – один из наиболее часто применяемых инструментов в биохимии и метаболомике. Оба масс-спектроскопических метода имеют свои достоинства и недостатки. Во-первых, для них требуется высокая химическая чистота анализируемого вещества. ESI является более «мягким» способом ионизации, чем MALDI. При ESI образуется непрерывный поток ионов, при MALDI – очень ограниченный во времени (до 10 нс) пакет ионов; при этом ESI-анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества, MALDI – в 10 раз меньше. Но все эти замечания чисто технические и свидетель­ствуют лишь о том, что методы масс-спектрометрии биологических молекул сегодня стали доступны и широко используются в научных экспериментах и клинических исследованиях. Кроме того, сильные стороны этих методов хорошо дополняют друг друга, исполняя роль поистине мощного аналитического инструмента.

…К настоящему моменту история развития масс-спектрометрии насчитывает вторую сотню лет. Но лишь совсем недавно, как сказал Джон Фенн в своей Нобелевской лекции, «…молекулярные слоны смогли летать на ионных крыльях».

Медицинская протеомика – новая и перспективная область биомедицинских исследований, позволяющая адаптировать достижения функциональной протеомики, геномики и биоинформатики в буквальном смысле непосредственно «к жизни», т. е. использовать имеющиеся знания для клинического анализа биологических образцов, взятых у пациентов.

Современные достижения

Над поиском протеомных маркеров значимых заболеваний интенсивно работают исследователи всего мира – не только ученые из академических институтов, но и специалисты из исследовательских подразделений крупных и средних фармацевтических компаний.

Уже достигнуты определенные успехи в одной из самых проблемных областей медицины – ранней диагностике тяжелых заболеваний. В первую очередь это относится к раку предстательной железы (Downes et al.

, 2007; Larkin et al., 2010).

Диагностика этого широко распространенного заболевания, проводящаяся по наличию в моче пациента белка простатспецифического антигена, – на сегодняшний день одна из самых ранних и точных.

К настоящему времени достигнуты неплохие результаты и в выявлении маркеров рака молочной железы (Mathelin et al., 2006; Gast et al., 2009). Из-за широкой клинической вариабельности этого заболевания в качестве маркеров предлагается использовать набор из 40 белков.

Такой белковый профиль позволяет не только с высокой точностью диагностировать заболевание, но и прогнозировать эффективность лечения.

Основные диагностические белки этого набора – гаптоглобин, трансферрин, аполипопротеины A-I и C-I – уже сегодня используются при диагностике рака молочной железы.

Ведутся исследования и по обнаружению маркеров нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, склерозов различной этиологии и т. д. (Cedazo-Minguez, Winblad, 2010). В этой области основными прогностическими маркерами являются ангиогенин (фермент, обеспечивающий рост кровеносных сосудов), креатининкиназа, фибриноген, аполипопротеин Е (Bowser, Lacomis, 2009)

В Сибири проблемами структурной и функциональной протеомики интенсивно занимаются в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. В результате совместной работы с НИИ Психического здоровья ТНЦ СО РАМН проведена большая работа по поиску белков-маркеров шизофрении.

Этиология и патогенез этой тяжелейшей психической болезни неизвестны. Согласно одной из теорий возникновения шизофрении, в основе заболевания лежит нарушение белкового обмена.

Сравнение протеомных профилей статистически достоверной выборки людей, страдающих шизофренией, и протеомных профилей здоровых добровольцев уже позволило исследователям выявить опредленный набор белков в качестве маркеров: аполипопротеин A-II, фосфомевалонат киназу и сериновую (треониновую) киназу.

Дальнейшие усилия ученых будут направлены на уточнение роли этих белков в патогенезе болезни и внедрение этих маркеров в клиническую биохимию.

У работы исследователей-протеомщиков огромный потенциал и перспективы. Учитывая то, что в организме человека число различных белковых молекул и их вариантов может составлять миллионы, ученые уверены, что их высокотехнологичная белковая «рыбалка» будет и в дальнейшем гарантированно приносить богатый улов. Успехи последних лет в этой новой биомедицинской области внушают обоснованный оптимизм.

Литература

Cox J., Mann M. Is proteomics the new genomics? // Cell. 2007. V. 130(3). P. 395—398.

Capelo J.L., Carreira R., Diniz M. et al. Overview on modern approaches to speed up protein identification workflows relying on enzymatic cleavage and mass spectrometry-based techniques // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 650. N 2. P. 151—159.

Ulrich-Merzenich G., Panek D., Zeitler H. et al. New perspectives for synergy research with the «omic»-technologies // Phytomedicine. 2009. N. 6—7. P. 495—508.

Feng X., Liu X., Luo Q., Liu B.F. Mass spectrometry in systems biology: an overview // Mass Spectrom. Rev. 2008. V. 6. P. 635—660.

: 11 Май 2010 , Академия обществу , том 32, №2

Источник: https://scfh.ru/papers/proteomika-vysokotekhnologichnaya-rybalka/

Vse-referaty
Добавить комментарий