Световая микроскопия

Световая микроскопия

Световая микроскопия

Световая микроскопия

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона.

Если это различие составляет менее 3 – 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали.

На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100.

Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается.

Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива.

Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA.

Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.

В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения.

Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения – разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд.

Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора.

В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете ( Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н.

конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса).

Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.

У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Проведение темнопольного исследования

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

Устанавливают свет по Келеру;

Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;

На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;

Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;

Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;

С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);

Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол – конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения.

При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов.

При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно.

Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод фазового контраста

Метод фазового контрастаи его разновидность — т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани.

Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф).

Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое.

Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

Набора объективов со специальными фазовым пластинками;

Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;

Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой “0”);

Настраивают свет по Келеру;

Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

Источник: https://mirznanii.com/a/9747/svetovaya-mikroskopiya

Микроскоп и микроскопические методы исследования

Световая микроскопия

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.

) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы – это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой.

Отечественные микроскопы (Биолам”, “Бимам”, “Микмед”) имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С – студенческие, Р – рабочие, Л – лабораторные, И – исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

1. Источник света; 2. Коллектор; 3. Ирисовая полевая диафрагма; 4. Зеркало; 5. Ирисовая аппертурная диафрагма; 6. Конденбсор; 7. Препарат; 7'.

Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое ; объективом; 7''. Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре; 8. Объектив; 9.

выходной значок объектива; 10. Полевая диафрагма окуляра; 11. Окуляр; 12. Глаз.

Основную роль в получении изображения играет объектив. Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.

Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки.

Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,— зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом.

Угловая апертура—это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива.

Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

где R – предел разрешения; – длина волны; NA – числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500—1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х).

«Сухой» объектив – это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.

В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии—кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло.

Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин.

Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом. **Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены.

В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами.

Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО – апохромат и т. п.

); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии—обозначение МИ и черное кольцо. Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х).

При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.

Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.

Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.

Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения н фокусировка микроскопа

Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии.

Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру, который заключается в следующем: 1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа; 2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа; 3)помещают препарат на предметный столик микроскопа; 4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе; 5) убирают лист бумаги с зеркала; 6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа). 7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы; 8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата; 9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка); 10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора; 11)при смене объектива необходимо проверить настройку света. После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное – к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение – с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом

При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров. Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе.

При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики.

Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию. С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы — это приведет к их порче.

По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная, темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют электронную микроскопию.

Источник: https://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/bacter/microscop.htm

Световая микроскопия. Устройство. Принцип работы светового микроскопа

Световая микроскопия

Световая микроскопия
Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм. Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 -4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Микроскоп является прибором, позволяющим увеличивать изображение предмета (клетки растения) в сотни и тысячи раз. Микроскоп был изобретен в Голландии А.Левенгуком. Тогда же начали изготавливать микроскопы, увеличивающие предметы до 270 раз.

Постепенно развивались технологии в оптике, вследствие чего появились более качественные линзы и более прочные удерживающие конструкции, благодаря чему получается точное изображение. В настоящее время производят оптические микроскопы, дающие тысячекратное увеличение при микроскопии. Уже в ХХ веке был сконструирован электронный цифровой микроскоп, увеличивающий предмет в сотни тысяч раз.

В школе на уроке биологии используют световой микроскоп. Строение светового микроскопа таково: окуляр (два увеличительных стекла, помещеные в оправу) и объектив (также состоит из увеличительных стекол в оправе), вставленные в прикрепленный к штативу тубус. Также к штативу крепится предметный столик с зеркалом под ним.

Главный принцип работы светового микроскопа состоит в том, что через прозрачный или полупрозрачный предмет (объект исследования), размещенный на предметном столике, проходят лучи света и попадают на систему линз объектива, которые увеличивают изображение. Эту же роль играют линзы окуляра, через которые исследователь изучает объект.

При работе с микроскопом следует соблюдать определенные правила. Микроскоп нужно повернуть штативом к себе, а отраженный от зеркала луч света должен попадать в отверстие предметного столика. Подготовленный препарат размещают на предметном столике и закрепляют зажимами.

Посредством винта медленно опускают тубус так, чтобы объектив остановился на расстоянии 1-2 мм от предметного стекла. После этого следует плавно поднимать тубус, пока не станет видна четкая картина препарата. Таким образом, достичь четкого изображения предметов возможно с помощью регулирующих винтов, расположенных сбоку на корпусе микроскопа.

Они изменяют расстояние от линз до объекта. В конструкции некоторых микроскопов вместо линз перемещают платформу предметного столика вместе с объектом.

В состав микроскопа входят три функциональных элемента: осветительная часть, воспроизводящая и визуализирующая. Осветительный элемент создает световой поток для освещения объекта исследования для того, чтобы возможно его было увеличить и рассмотреть. В осветительную часть входят источник света и оптико-механическая система.

Предназначение воспроизводящей части микроскопа – воспроизведение изображения предмета в плоскости с необходимым качеством изображения и кратностью увеличения. Воспроизводящий элемент – это объектив и промежуточная оптическая система.

Визуализирующий элемент необходим для получения изображения предмета на сетчатке глаза, фотопленке, экране и дополнительного увеличения.

В визуализирующую часть входят монокулярная, бинокулярная и тринокулярная визуальная насадка с наблюдательной системой (окулярами), проекционные насадки, системы дополнительного увеличения, рисовальные аппараты, системы анализа и документирования изображений. Наличие дополнительных систем зависит от типа микроскопа.



Источник: https://infopedia.su/20x70e8.html

Методы световой микроскопии

Световая микроскопия

Методы освещения и наблюдения (микроскопия). Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления.

Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в М.

выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

v Метод светлого поля.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие). Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Поглощающие элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет.

Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов и различных минералов.

Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы.

Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

v Метод темного поля в проходящем свете.

Метод тёмного поля в проходящем свете применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля.Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля.

По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса).

Изображение в микроскопе создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.

У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Настройка микроскопа аналогична для микроскопов с различными типами освещения любого производства. Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.

Наибольшее применение метод нашел для подсчета бактерий. Этот наиболее простой в реализации метод контрастирования. В темнопольном освещении объекты освещены световым кольцом, внутренний диаметр которого больше, чем диаметр поля зрения объектива. Таким образом прозрачные объемные объекты освещены вследствие рассеяния светового потока, а фон препарата остается не подсвеченным (темным).

v Метод фазово-контрастной микроскопии.

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани.

Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф).

Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е.

в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным.

Метод может быть реализован двумя способами:

1. расположением элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно;

2. расположением этих элементов вне объектива и окуляра внутри самого микроскопа.

Первый способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, содержащих фазовые объективы и специальный конденсор с набором световых колец (встроенных в конденсор или выполненных в виде вкладышей). Приобретаются отдельно от микроскопа.

Второй способ реализуется с помощью соответствующих колец, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и в вынесенную с помощью дополнительных линзовых элементов плоскость выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив — обычные. Чаще всего этот способ реализуется в современных инвертированных микроскопах.

Фазовые объективы внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 1/2—2/3 от диаметра выходного зрачка объектива при этом светопропуска-ние кольца — 10—30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернее его изображение, подбирается таким образом, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

В типичной для этого метода схеме (рис. на стр.9) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом.

Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на l/4 (l — длина волны света).

В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы.

С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или l/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата.

Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля.

Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

v Метод инвертированной световой микроскопии.

Инвертированные микроскопы проходящего света представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа: осветитель проходящего света расположен над объектом и имеет большое рабочее расстояние, тем самым обеспечивается свободный доступ инструмента (манипулятора, палочки, пипетки) к препарату, который находится, например, в чашке Петри.

Специальные объективы установлены в револьверное устройство под предметным столиком.

Объективы имеют большое и сверхбольшое рабочее расстояние по сравнению с обычными объективами, так как рассчитаны на работу с «покровным» стеклом (от 0,5 до 2,5 мм, иногда до 5 мм), которым является дно посуды, а также на работу в достаточно большом слое питательной среды в таком же диапазоне.

v Метод флуоресцентной (люминесцентной) микроскопии.

Освещение объектов светом, возбуждающим люминесценцию, производится сверху через опак-иллюминатор и объектив. Современные люминесцентные микроскопы обычно являются вариантом модульной конструкции основной серии биологического микроскопа.

Люминесцентный микроскоп отличается от биологического (проходящего света) наличием осветителя падающего (отраженного) света и дополнительных узлов, связанных со светофильтрами. В качестве источника света для люминесцентного осветителя используются ртутные лампы.

При работе в свете люминесценции необходимо пользоваться только специальными люминесцентными объективами и нелюминесцирующими иммерсионными жидкостями (водная иммерсия и нелюминесцирующее масло).

При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра.

Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта, либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами.

Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции.

В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Различают первичную флюоресценцию (собственной флюоресценцию, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена) и вторичную, или наведенную (возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии).

Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов.

v Метод иммунофлуоресценции.

Иммуноцито-, гистохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам. Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований:

― структурных компонентов клетки,

― клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов),

― рецепторов клеточной поверхности.

Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток: флуоресцентные красители, ферментные метки, металлы, металлопротеины, радиоизотопы.

Выделяют 2 метода иммунофлуоресценции.

1. Прямой метод. Визуализация тканевых антигенов производится непосредственным конъюгированием их с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод появился первым и является низкочувствительным.

По методике специфические антитела метят флуоресцирующим красителем (например, акридиновым оранжевым), не меняющим их свойств, и «наносят» на препарат. Полученный препарат анализируют в люминисцентном микроскопе.

При этом будут флуоресцировать только те участки препарата, которые содержат антиген.

Исследуя с помощью иммунофлуорисценции образование комплекса “антиген-антитело”, для метки антител используют краситель, меняющий флуоресцентные свойства при соединении антител с антигеном.

2. Непрямой метод. Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с развитием непрямого способа.

В непрямом методе в качестве первых антител используют немеченые антитела к клеточным антигенам а в качестве вторых – меченые флуорохромом антитела. В результате первые антитела соединяются с антигеном, а вторые – с первыми.

Следует отметить, что при непрямом методе увеличивается чувствительность (усиливается окрашивание) и специфичность (способность связываться только с определенными антигенами) метода.

Типы антител:

v Моноклональные антитела. Получили свое название от того, что из одной клетки, производящей антитела к нужному антигену, получают целые колонии таких же клеток (моноклон).

Клетки, которые производят одинаковые антитела к определенной опухоли, назвали «гибридомами».

Они представляют собой уникальные природные «фабрики», способные в неограниченном количестве производить моноклональные антитела.

Моноклональные антитела вырабатываются клонами плазматических клеток. Антитела определенного клона иммунохимически идентичны и реагируют со специфическим эпитопом антигена, против которого они образованы (рис. 5). Возможно, по причине экономии, мышей принято использовать почти эксклюзивно для продукции моноклональных антител.

После достижения иммунного ответа выделяют В-лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и соединяют их в специальных условиях с клетками несекретирующей мышиной миеломы. В то время как В-лимфоциты производят специфические антитела, клетки миеломы дают гибридные клетки (гибридомы), которые долго живут в культуральных условиях.

Нереактивные В-клетки и клетки миеломы убирают и культивируют антителопродуцирующую гибридому, тестируя ее на желанную реактивность. Размножение можно проводить в культуре или трансплантацией гибридомы в брюшную полость сингенной мыши.

Так можно получить большое и, по крайней мере теоретически, неограниченное количество моноклональных антител со специфическими характеристиками.

Таким образом, моноклональные антитела – это гомогенные антитела, продуцируемые гибридными клетками, в которых сочетаются способность синтеза специфических иммуноглобулинов одного изотипа с неограниченной пролиферацией. Методику получения таких гибридных клеток, иначе называемых гибридомами (hybridomas), разработали Дж. Колер и К. Мильштейн в 1975 г.

В общих чертах она состоит в том, что лимфоциты иммунизированного животного, например, мыши, гибридизуются с культивируемыми в среде опухолевыми клетками, в данном примере — мышиными миелобластами; в процессе пассажей гибридом удается проводить отбор клонов, синтезирующих антитела с интересующей исследователя специфичностью.

Главным преимуществом моноклональных антител является именно стандартная и воспроизводимая в пассажах специфичность в отношении конкретного эпитотипа (химическая структура на поверхности сложно построенного антигена; в силу особенности своей конфигурации способна взаимодействовать с комплиментарной ей структурой в составе антитела (паратопом), определяя тем самым специфичность данной серологической реакции).

Изобретение технологии получения МКА было отмечено в 1980 году Нобелевской премией.

Оно, прежде всего, явилось мощным инструментом для научных исследований в области биологии, иммунологии и медицины и открыло широкие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств в онкологии.

К настоящему времени получено громадное количество гибридом-продуцентов моноклональных антител к различным, в том числе к опухоле-ассоциированным антигенам.

v Поликлональные антитела продуцируются различными клетками, и как следствие, иммуннохимически разнородны. Они реагируют с разнообразными эпитопами антигена, против которого они продуцированы. Наиболее часто используемое животное для получения поликлональных антител – кролик, далее следует козел, свинья, овца, лошадь, морская свинка и другие животные.

В зависимости от иммуногенности антигена дозы от 10 до 200 мг часто употребляются для индукции иммунного ответа у животных. Антиген часто вводят внутри- или подкожно, однако также часто используют внутримышечные инъекции или инъекции в перитонеальную полость.

У кроликов небольшие объемы (0,1-0,5 мл) обычно вводят внутрикожно; антиген разведен или суспензирован в равном объеме адъюванта, например таком как полный или не полный адъювант Фрэйда. Вспомогательную дозу постоянно раз в месяц или при уменьшении титра, увеличивает или поддерживает уровень антител.

Кровь добывается из уха у кроликов, яремной вены (у больших животных) или из сердца, часто убийством животного. После удаления клеток, поликлональные антитела могут быть получены или в форме цельной стабилизированной антисыворотки, или разделено на фракции различной степени отчистки.

Осаждение солями, после которой используется ионообменная хроматография, способствует удалению большей части других сывороточных протеинов. Афинная хроматография может быть использована для изотипии антигенспецифических антител и отделения их от перекрестнореагирующих антител к другим видам, особенно иммуноглобулинов человека.

v Метод поляризационной микроскопии.

См. учебник.

v Метод конфокальной микроскопии.

Конфокальный микроскоп впервые был сконструирован в 1957г.

Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности – исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т.е.

клеточной активности) в четырех измерениях – высота, ширина, глубина и время. Использование микроскопа дает возможность получения “оптических срезов” толстых полупрозрачных объектов без их препарирования.

v Метод наблюдения в УФ-лучах.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см.

выше) от длины волны λ применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей λ = 400—250 нм, тогда как для видимого света λ = 700—400 нм).

Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях.

Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.

); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа. Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана.

Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

v Метод наблюдения в ИК-лучах.

Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.

v Методы обработки изображения.

Современное развитие науки и техники предусматривает применение современных методов обработки изображения и документирования с элементами сбора, систематизации и анализа информации.

К таким приборам относятся анализаторы изображения, получившие свое развитие с конца 80-х годов ХХ-го века.

Базовым микроскопом может служить в принципе любой микроскоп, имеющий дополнительный вывод изображения в плоскость, сопряженную с фотопленкой или видиконом передающей камеры.

В зависимости от задач применяется цветная или черно-белая телевизионная камера. С ее помощью изображение препарата передается на видеоконтрольный монитор. Монитор выполняет несколько задач:

— позволяет сберечь зрение, облегчая поиск нужного участка изображения,

— делает работу с микроскопом более комфортной,

— позволяет демонстрировать и обсуждать интересующие и спорные участки изображения.

На современном этапе в комплекты, в основном зарубежных, анализаторов изображения включается цифровая черно-белая камера, которая работает с накоплением, т.е. позволяет «видеть» даже объекты, имеющие малое свечение и, следовательно, невидимые глазом.

Изображение с монитора передается в компьютер, оснащенный специальной программой для анализа изображений. С помощью компьютера выполняется та часть работы, которая связана с получением и анализом необходимой информации по изображению и его элементам.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/4_14996_metodi-svetovoy-mikroskopii.html

Методы контраста в световой микроскопии (I часть)

Световая микроскопия

3 Февраля 2019

Человеческий глаз может различать объекты, если они отличаются от фона яркостью, цветом, насыщенностью, удалённостью и тому подобным. Оптический контраст прямо пропорционален разности яркости объекта наблюдения и фона, и обратно пропорционален яркости объекта наблюдения: K (контрастность) = (B1-B2)/B1.

Для контрастирования могут использоваться различные фильтры, пластинки с прорезями, линзы и зеркала, устанавливающиеся в оптическом канале.

Эти элементы: отсекают определённую область спектра электромагнитного излучения, задерживают ход лучей, изменяют угол падения светового пучка, собирают или рассеивают лучи света.

Светлое поле – это метод освещения конусом света, который преломляется, отражается и рассеивается от образца, формируя изображение. Пройдя через образец или отразившись от него, свет проходит через объектив, тубусную призму, линзы окуляров/c-mount адаптеров и регистрируется камерой или глазами.

Нюансов не много: как минимум, нужно достаточно света, чтобы отчётливо увидеть объект и нужен конденсор, для равномерного распределения света в поле зрения. Если другие методы контрастирования не требуются, то используйте Olympus CX23, CX33 и Hund MedPrax.

При светлом поле важное значение имеет именно центровка освещения, настройка «освещение по Кёллеру». При таком освещении, свет попадает в отверстие апертурной диафрагмы конденсора, ограничивающей размер пучка света.

Регулируя диаметр апертурной диафрагмы можно изменять максимальный угол конуса освещения образца, а полевой диафрагмой можем регулировать размер освещаемой площади.

Рис. 1. Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа

Тёмное поле – это метод контрастирования, при котором образец освещается полым конусом света, который рассеивается от образца и формирует изображение. Метод был разработан Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 году и подходит только для объектов минимально отражающими и поглощающими свет, то есть, предназначен для микроскопирования прозрачных объектов.

Рис. 2. Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете.

Темнопольные объективы (рисунок 2, слева) для исследований в отражённом свете кардинально отличаются от светлопольных: от осветителя свет проходит через диафрагму (это исключает засветку по центру) по каналам в стенке объектива и падают на образец по касательной под таким углом, чтобы рассеиваться от неровностей и не попадать в оптический канал объектива. То есть ровную поверхность мы не видим (так как она не рассеивает свет) – это тёмная область в поле зрения, а все неровности – светлые. Для этого метода исследования используются темнопольные микроскопы Olympus BX43 и BX53M.

Из особенностей этого метода надо отметить, что, если у объективов будет слишком высокая апертура, а значит и большой угол конуса раскрытия света, то часть света не рассеется от образца, а отразится от поверхности и попадёт в объектив. Для того, чтобы этого избежать, в темнопольных объективах установлена ирисовая диафрагма, которую вы можете видеть, например, в объективах с большим увеличением UPLFLN100XOI2/1.3.

Рис. 3. Трепонема в тёмном поле.

Фазовый контраст – это метод преобразования сдвига фаз в изменения амплитуды световой волны, то есть, яркости. Фазовые изменения, которые зависят от толщины, состава, геометрии и т.д. возникают из-за различных показателей преломления в прозрачных объектах, а, следовательно, разности ходов лучей.

Рис. 4. Клетка в фазовом контрасте.

Метод фазового контраста был разработан в 1934 году Ф. Цернике, который через 19 лет получил мировое признание и стал лауреатом Нобелевской премии в области физики.

С помощью этого метода впервые стало возможно наблюдать структуру неокрашенных клеток.

Диаметр клетки без ядра может быть меньше 1 мкм и не обладать свойствами поглощения видимой области светового спектра, что затрудняет её наблюдения по методам светлого и тёмного поля.

Рис. 5. Устройство фазового контраста.

Фазовый контраст основан на том, что сдвиг фазы лучей, проходящих через биологические объекты, примерно равен (90°). Чтобы понять область применения метода, объясним, как он работает.

Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума, взаимодействие со средой приводит к изменению амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, который часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов.

Обратите внимание на график, есть две оси: амплитуда и время. Нам сейчас интересно смещение волн по оси времени, без изменения фазы. Проходя через клетки, фаза смещается, примерно, на четверть от первоначальной длины волны. Теперь посмотрите на рисунок 5.

Проходя через кольцевую диафрагму, свет падает полым конусом на объект, проходит через него, разделяется на два луча: один луч (полая воронка света, фоновый свет) попадает в объектив, не преломляясь от клетки и проходит через фазовую пластинку, на которой, в канавке между центром и краем, нанесен специальный материал, задерживающий свет на -90° (тогда это отрицательный фазовый контраст) либо наоборот сдвигающий на +90° (положительный фазовый контраст); второй луч преломляется, рассеивается (становится дифрагированным) в фазовом объекте (клетки, маленькие кристаллы и т.д.) и тоже приобретает сдвиг по фазе.

Рис. 6. Фазовые пластинки.

Фоновый свет, пройдя через канавку в фазовом кольце, распределится более-менее равномерно во всём поле зрения и произойдёт интерференция когерентного света (ведь свет, замедленный при прохождении через клетку, находится в той же фазе). Таким образом Вы видите увеличение амплитуды там, где фоновый свет, накладывается на дифрагированный.

Такой метод подойдёт только для тонких объектов, потому что длина волны видимого света мала, и чтобы хорошо видеть сдвиг, необходимо, чтобы объект смещал его примерно на 90°. Через напыление в канавке фазового кольцо проходят не только фоновые волны, но и дифрагированные волны смещаются по фазе, однако они не интерферируют и не искажают картину.

Качественный фазовый контраст легко настроить на микроскопах Olympus CX43, BX53, CKX53 и IX53. Настраивая фазовый контраст, необходимо совместить кольцо света, прошедшего через фазовую пластинку конденсора, с фазовым кольцом объектива.

Симулятор настройки фазового-контраста: https://www.olympus-lifescience.com/ru/microscope-resource/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/

Поляризационный контраст – это оптический метод обнаружения, определения свойств и строения анизотропных объектов по характеру их двулучепреломления и цвету.

Явление поляризации света при отражении открыл Этьен Луи Малюс в 1808 году, а двумя годами позже предложил метод определения оптической оси кристалла. Не менее важный вклад внёс Дэвид брюстер, открыв 1815 двулучепреломление в средах с искусственной анизотропии и круговую поляризацию.

Открытие поляризации дало возможность исследователям наблюдать поведение света при прохождении через кристаллы. Например, если просматривать текст через исландский шпат CaCO3, то вы увидите, как текст двоится (см. рисунок 7).

Рис. 7. Двойное лучепреломление.

Рис. 8. Оптическая ось кристалла.

Так как, разные кристаллы «раздваивают» свет по-разному, их можно классифицировать по светопреломлению. Обратите внимание на рисунок №8. Падающий пучок разделяется на обыкновенный и необыкновенный лучи. Буквенные обозначения ne и no – это показатели преломления необыкновенного луча и обыкновенного – соответственно. Ниже приведём таблицу этих показателей.

Кристаллn0neмаксD = neмакс – n0
Исландский шпат1,658361,48639-0,17197
Кварц1,54421,5533+0,0091
Каломель1,97332,6559+0,6826
Натриевая селитра1,5871,336-0,251

Чтобы отсечь фоновый свет, который состоит из множества электромагнитных волн, колеблющихся в разных плоскостях и направлениях, необходимо использовать поляризаторы, поляроиды или поляризационные решётки. Щели в поляризационных решётках на столько малы, что через них проходят электромагнитные волны, лежащие в одной плоскости, как показано на рисунке 9.

Такой поляризованный свет, пройдя через лучепреломляющий материал, разложится на два луча. Непреломлённый луч, двигающийся в той же плоскости будет отсечён другой решёткой, повёрнутой на 90º, по отношению к первой решётке.

В итоге, если исследуемый образец находится между двумя скрещенными поляризационными решётками, поляризаторами или поляроидами, то на выходе будет виден только преломлённый свет.

Рис. 9. А – источник света. В – неполяризованный свет. С – поляризационная решётка. D –поляризованный свет.

В поляризационном микроскопе можно увидеть не только двулучепреломление, но и дихроизм (свойства некоторых кристаллов поглощать больше одни волны одной длины, чем другой), фотоупругость (изменение цвета анизотропных участков в изотропных средах, под действием механических напряжений), отследить вращение плоскости поляризации, а также интерференцию поляризационных лучей. В некоторых кристаллах (кварц, киноварь), чистых растворах (скипидар) и газах, наблюдается вращение плоскости поляризации. При этом происходит изменение интенсивности света, это связано с поворотом электрического вектора световой волны. В чистых веществах, по изменению интенсивности света при вращении плоскости поляризации, судят о толщине слоя вещества, концентрации оптически активных частиц и других характеристиках.

Рис. 10. Фотоупругость.

Интерференцию поляризованных лучей в кристалле используют в кристаллооптике для определения структуры и ориентации осей кристалла, а в минералогии для определения минералов и горных пород, для обнаружения напряжений и деформаций в твёрдых телах. Во многих кристаллографических лабораториях и бюро СМЭ, используются поляризационные микроскопы Olympus BX53P и Hund H600POL.

Стоит заметить, что поляризационные фильтры используют и для снижения бликов и засветов, потому что из всех электромагнитных волн, колеблющихся в разных плоскостях, остаются только те, которые колеблются в плоскости поляризатора и не интерферируют между собой.

Дифференциально-интерференционный контраст – это метод изучения преломляющей способности анизотропных сред по интерференции поляризованных лучей, проходящих через них.

Рис. 11. Виды поляризации. Поляризация описывается фигурами Лиссажу и соответствует сложению поперечных колебаний равной частоты

В отличии от ранее рассмотренного поляризационного контраста, при ДИК микроскопии, между поляризатором и анализатором устанавливается призма Номарского, которая разделяет свет на два отдельных световых луча с ортогональной плоскостью поляризации. Эти два световых луча проходят вблизи друг друга через образец.

Поскольку они испытывают различное преломление или рассеяние в образце, происходят разные фазовые сдвиги. Пройдя через образец лучи соединяются и преобразуются в эллиптически поляризованные лучи. Обратите внимание на рисунок 11, красным и зелёным цветом показаны магнитное и электрическое поля.

Если их фазы совпадают, то свет линейно-поляризован, но если они движутся в разных фазах, то колебания света (голубая линия) приобретают эллиптический вид.

Преобразуется эллиптически поляризованный свет в амплитудный сдвиг волны, с помощью анализатора. Таким образом, можно сделать видимыми фазовые сдвиги разностей длин волн до 1/200 длины волны (или даже 1/1000 длины волны с использованием камеры) и всей длины волны.

Рис. 12. Amoeba Proteus. Слева ДИК, справа – светлое поле.

Рис. 13. Схема ДИК микроскопии в проходящем свете.

Дифференциально-интерференционный контраст по пунктам:

  1. Исходно неполяризованный свет поляризуется, проходя через поляризатор. Плоскость поляризации наклонена на 45º к оси изображения.
  2. Поляризованный свет проходит через призму Номарского (которая состоит из двух преломляющих призм Волластона) и расщепляется на два пучка волн со взаимно перпендикулярными плоскостями поляризации.
  3. Два луча сфокусированы с помощью собирающей линзы конденсора (или объектива, если в отражённом свете) перед прохождением через образец. Лучи сфокусированы так, что они проходят через две соседние точки образца, расстояние между которыми приблизительно 0,2 мкм.
  4. Лучи (с поляризацией 0º и 90º) проходят через области с разной оптической плотностью, от чего у них разное время прохождения через образец (различия по фазе).
  5. После этого, два пучка попадают в объектив, отражаясь от образца, либо проходя через него.
  6. При исследованиях в отражённом свете, лучи проходят ещё раз через призму ДИК, но с поляризацией 135° по отношению к плоскости рисунка, а в проходящем свете, через ещё одну призму Номарского, находящуюся за объективом. Освещение объекта двумя лучами с разной поляризацией, формирует два, немного смещённых, изображения. Пройдя ещё раз через ДИК призму, лучи накладываются, что приводит к их интерференции и мы наблюдаем объёмное изображение. Изменение цвета при ДИК – интерференционная окраска, возникает из-за интерференции лучей с разными фазами.

Для дифференциально-интерференционного контраста микроскопии требуется просветлённая оптика с максимальной пропускной способностью и без напряжений, то есть Планфлуорит, которой комплектуются Olympus BX63 и BX53M.

Рис. 14. Формирование изображения при дифференциально-интерференционном контрасте.

Перейти на страницу с микроскопами в нашем каталоге

Источник: https://www.microsystemy.ru/info/articles/metody-kontrasta-v-svetovoy-mikroskopii-i-chast/

Введение в клеточную биологию :: Теория и практика :: Методы исследования клетки

Световая микроскопия

  • Световой микроскоп и изображение пыльцевых зерен, сделанное с его помощью
  • Люминесцентный микроскоп и изображения, сделанные с его помощью: прорастание пыльцевой трубки сквозь стенку пыльника и семязачаток.
  • Конфокальный микроскоп и изображения, сделанные с его помощью: растрескивание пыльника, сосуды ксилемы, хлоропласты в клетках рыльца.
  • Одним из главных методов цитологии на сегодняшний день остается микроскопия, предназначенная для изучения структуры клетки, она широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. Изобретение микроскопа связывают с именами Галилео Галилея (итал.) и братьев Янсен (гол.) в 1609–1611 гг. Термин «микроскоп» был предложен Фабер (нем.) в 1625 г.

    На настоящий момент существует два основных вида микроскопии – световая и электронная. Различия между ними состоят в принципе рассмотрения объекта. В первом случае объект рассматривают в потоке видимой части электромагнитного излучения (длина волны = 400–750 нм), во втором случае – в потоке электронов. Эти два метода имеют разную разрешающую способность.

    Разрешающая способность или предел разрешения – это минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно. Предел разрешения микроскопа задается длиной волны потока излучения, в котором изучается объект.

    Поэтому излучение данной длины волны может быть использовано для исследования только таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны самого излучения. Предел разрешающей способности световой микроскопии был достигнут конструкторами микроскопов еще в конце 19 века, и составил 0,2 мкм.

    Это значит, что два объекта, если они разделены расстоянием менее 0,2 мкм, будут выглядеть как одно целое, даже если мы будем сильно увеличивать изображение, например, проецируя его на экран.

    Поэтому, с помощью светового микроскопа не удается рассмотреть две центриоли в клеточном центре, они выглядят как одна точка (надо сказать, что в современных микроскопах, производимых серийно, максимальная разрешающая способность не реализуется).

    В связи с ограничением разрешающей способности светового микроскопа он может быть использован для изучения ограниченного числа внутриклеточных структур, включая: ядро, пластиды, крупные вакуоли, оболочку растительной клетки.

    Мельчайшими объектами, четко различимыми в световом микроскопе являются бактерии и митохондрии, размеры которых составляют около 500 нм (0,5 мкм), более мелкие объекты видны нечетко, повышение точности обработки линз не может преодолеть это ограничение, которое задано волновой природой света.

    Разрешающая способность зависит не только от длины волны источника освещения, но и от коэффициента преломления среды, через которую происходит наблюдение объекта, а также от угла наклона, под которым лучи освещения входят в объектив.

    Стандартный набор объективов микроскопа составляют: объективы малого увеличения ( х8) с апертурой А=0,2 и объективы большого увеличения (х20) с А= 0,40 и – (х40) с А= 0,65. Эти объективы называют «сухими», так как рассмотрение объекта с их помощью происходит через воздушную среду (коэффициент преломления n=1).

    Но большинство микроскопов оснащены, кроме этого, специальными иммерсионными объективами, для которых необходима специальная иммерсионная среда (n=1). Такой средой может быть вода, объектив х40 ВИ имеет апертуру 0,75. Наиболее распространена масляная иммерсия (n=1,51), при х90 значение апертуры объектива А=1,25.

    В случае использования иммерсии улучшается разрешающая способность светового микроскопа. Однако, у объективов с высокой разрешающей способностью имеются недостатки: небольшая глубина резкости и невысокая контрастность. Самым распространенным методом световой микроскопии является метод светлого поля, при котором световые лучи осветителя проходят через объект и попадают в объектив.

    Таким способом изучают клетки фиксированные и окрашенные. Открытие основных клеточных структур связано с разработкой и применением набора красителей, которые избирательно окрашивают компоненты клетки и обеспечивают контраст для их наблюдения. Имеется большое разнообразие красителей.

    Некоторые из них извлекаются из растений и животных, до сих пор не существует их синтетических аналогов. Например, широко используемый гематоксилин – экстракт тропического кампешевого дерева, кармин – пигмент жирового тела некоторых видов тлей. Все это так называемые ядерные красители, окрашивающие структуры, содержащие нуклеиновые кислоты.

    Применение неядерного красителя –азотнокислого серебра, позволило Камилло Гольджи в 1898 г. наблюдать и описать то, что позднее было названо аппаратом Гольджи. Окрашивание живой клетки возможно лишь в редких случаях, поэтому для их изучения используют другие методы.

    В отличие от метода светлого поля при наблюдении объектов методом темного поля лучи осветителя не попадают в объектив и изображение создается только рассеянными лучами, идущими от объекта. При этом на темном фоне можно увидеть светящиеся частицы, которые по своим размерам меньше, чем разрешающая способность объектива, хотя размеры и форму частиц определить трудно.

    Темнопольная микроскопия в проходящем свете используется для изучения прозрачных объектов обычно невидимых в светлом поле и, особенно, для рассмотрения живых клеток. Совершенно по-разному на темном фоне выглядят живые и погибающие клетки. Протопласт погибающих клеток светится ярче, объяснения этому факту нет. Изобретен этот метод Зигмонди (австр.) в 1912 г.

    В световой микроскоп можно различать объекты, изменяющие амплитуду лучей освещения, однако живые клетки прозрачны для видимого света и лучи, проходя через клетку, практически не меняют амплитуды. Человеческий глаз не способен воспринимать смещение фазы лучей без изменения амплитуды.

    Поэтому специально для изучения живых клеток используются методы фазово-контрастной (изобретен Зернике (голл.) в 1934 г.) и интерференционной микроскопии (изобретен Лебедевым в 1932 г.). В таких системах прохождение света через живую клетку сопровождается изменением фазы световой волны. Свет задерживается, проходя через толстые участки клетки, например, через ядро.

    Возникает рекомбинация двух наборов волн, которые создают изображение клеточных структур. Для изучения объектов, обладающих двойным лучепреломлением (крахмальные зерна, растительные волокна, кристаллы) используют поляризационную микроскопию, основы которой заложил Эбнер в 1882 г. В этом методе используют специальное устройство поляризатор, который преобразует разнонаправленные волны света и они приобретают одно направление. При флуоресцентной микроскопии объект рассматривают в свете, излучаемом им самим. Первый люминесцентный микроскоп сконструировали Келлер и Зиндентокф в 1908 г. В основе этого метода лежит способность ряда веществ, при освещении коротковолновыми лучами (фиолетовыми или ультрафиолетовыми), светиться. Часто люминесцентная микроскопия используется для выявления специфических белков, антител, впервые использовал флуорохромы для связывания с антителами Кунс, и эта реакция получила его имя. В цитоэмбриологических исследованиях этот метод используют для изучения структур, содержащих углевод каллозу. Для этого метода используют специальную оптическую систему с ртутной лампой, связанную со световым микроскопом.

    В последнее время возможности световой микроскопии существенно увеличились благодаря использованию чувствительных видеосистем. Изображение, созданное световым микроскопом, подвергается обработке в видеокамере. Оно очищается от «шумов», преобразуется в цифровые сигналы и направляется в компьютер, где подвергается дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет достичь сильного контраста и анализировать прозрачные объекты и живые клетки.

  • Длительные непрерывные усилия по улучшению методов исследования принесли желаемые результаты в конце второй мировой войны. Именно тогда, благодаря удивительному стечению обстоятельств, почти в одно и то же время, ученые обогатились рядом новых мощных инструментов и методов исследования. В морфологии таким инструментом стал электронный микроскоп. Созданный еще в 30-е г. 20 века, он обладал достаточной разрешающей способностью, позволяющей проникнуть в клетку, вплоть до структур размером в нанометр. Вместе с тем, электронный пучок имел слабую проникающую способность, и это требовало приготовления очень тонких образцов материала и высокого вакуума. Такие жесткие требования создавали серьезные трудности, но в удивительно короткий срок удалось разработать методы для подготовки образцов тканей и сконструировать приборы для получения из них тонких срезов. Качество объектов неуклонно повышалось и к началу 60-ых годов были описаны многие из ранее неизвестных клеточных структур. Итак, разрешающая способность электронного микроскопа намного выше, чем светового. Теоретически при напряжении 100000 В его разрешение составляет 0,002 нм, но за счет коррекции электронных линз оно уменьшается и в реальности составляет у современных электронных микроскопов 0,1 нм. Значительные трудности наблюдения биологических объектов еще более снижают нормальное разрешение, оно не превышает 2 нм. Тем не менее, это в 100 раз больше, чем у светового микроскопа, поэтому электронную микроскопию называют ультрамикроскопической. Общая схема просвечивающего электронного микроскопа напоминает схему светового. Он существенно больше светового и как бы перевернут. В качестве источника излучения у электронного микроскопа служит нить катода, испускающая электроны (электронная пушка). Электроны испускаются с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы не было препятствий для движения электронов, происходит это в вакууме, разгоняются электроны анодом и проникают через крошечное отверстие в нижнюю часть колонны узким электронным лучом. Электронный луч фокусируется кольцевыми магнитами, расположенными вдоль колонны, они действуют подобно стеклянным линзам светового микроскопа. Образец помещается на пути электронного пучка. В момент его прохождения через образец часть электронов рассеивается в соответствии с плотностью вещества, остаток электронов фокусируется, образуя изображение на фотопластинке или на экране. Первый электронный микроскоп был создан Сименсом в 1939 г. Он позволил увидеть в клетке множество удивительных структур. Но для этого пришлось изобрести совершенно новые методы приготовления препаратов, которые стали применять с 1952 г. Фиксация клеток при этом проводится глутаральдегидом, ковалентно связывающим белки, а затем осмиевой кислотой, стабилизирующей белковые и липидные слои. Образец обезвоживают и пропитывают смолами, образующими после полимеризации твердый блок. Срезы для электронной микроскопии должны быть примерно 1:200 часть толщины одной клетки. Для изготовления таких срезов был создан ультрамикротом (1953) , в котором используются стеклянные или алмазные ножи. Полученные срезы помещают на специальную медную сеточку. Изображение в электронном микроскопе зависит от рассеивания электронов, которое определяется атомным числом вещества. Биологические объекты состоят главным образом из углерода, кислорода и водорода, которые обладают низким атомным числом. Для усиления контраста их импрегнируют тяжелыми металлами, такими как осмий, уран, свинец. Тонкие срезы при просвечивающей электронной микроскопии не позволяют судить о трехмерной структуре клетки, компенсировать этот недостаток можно серией срезов, по которой проводится реконструкция клетки. Это долгий процесс.

    Существует и прямой метод изучения трехмерного строения биологических объектов – сканирующая электронная микроскопия – она была создана в 1965 г.

    В этом случае для получения изображения используют электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, который должен быть зафиксирован, высушен и покрыт пленкой тяжелого металла.

    Этот метод применим только для изучения поверхностей и его разрешение невелико – около 10 нм.

  • Просвечивающий, зондовый и растровый электронные микроскопы. Электронмикроскопическое изображение поверхности пыльника и пыльцевого зерна
  • Классический световой микроскоп обладает низкой разрешающей способностью, что не позволяет изучать детали строения клетки размером менее 0,25 мкм. Второй этап изучения клетки относится к тому времени, когда микроскописты трудились над усовершенствованием своих приборов. В это же время – конец 18 в. – французский ученый Антуан де Лавуазье и англичанин Джозеф Пристли создают новую науку – химию. В отличие от морфологии, которая развивается от сложного к простому, химия продвигается от простого к сложному. Начиналась химия с идентификации элементов, атомов и затем продвигалась по пути изучения некоторых их наиболее простых комбинаций – молекул. Пересечь границу между неорганической и органической химией и позволить проникнуть в живой мир химии помог, впервые проведенный в 1828 г. Немецким ученым Фридрихом Велером, синтез биологической молекулы мочевины. Это стало началом применения химического подхода к изучению клетки. В последующие сто лет были открыты, очищены, структурно изучены и получены синтетическим путем аминокислоты, сахара, жиры, пурины, пиримидины и др. небольшие молекулы. Ученым удалось составить представление о метаболизме этих веществ в организме и путях образования из них основных биологических молекул: белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот. Но опять возникли труднопреодолимые препятствия на пути прогресса: перед сложностями структурной комплексности этих крупных молекул классическая химия оказалась бессильна. В течение длительного времени клетки изучали в основном путем наблюдения за ними. Но по мере развития экспериментального метода в естественных науках к нему начали прибегать и при исследовании живых организмов. Это облегчалось мощными биомедицинскими исследованиями проводимыми во второй половине 19 в. В начале 20 в. американец Росс Гаррисон и француз Алексис Каррель установили, что клетки животных можно культивировать в пробирке наподобие того как это делают с одноклеточными организмами. Тем самым они продемонстрировали способность клеток к независимой жизни и создали метод культивирования, который сейчас является одним из самых актуальных. Но все эти методы, по сути революционные, по-прежнему, были непрямыми, клетка оставалась закрытым черным ящиком. Сохранялась неизведанной огромная пропасть между наименьшей различимой в световом микроскопе частицей и наиболее крупной молекулой, доступной химическому исследованию. В этом неизведанном пространстве были скрыты важные понятия и концепции, неизвестными оставались функции, описанных клеточных структур, их связь с известными биомолекулами – без всего этого жизнь клетки оставалась неразгаданной. В свою очередь биохимия также обогатилась целым рядом принципиально новых приборов и методов. Особый интерес представляла хроматография, основанная на очень простом феномене – образовании каемки или ореола вокруг пятна (то, что мы видим, когда пытаемся вывести пятно специальным раствором). В основе этого явления лежат различия в скорости движения разных красок в потоке растекающейся жидкости. В начале 20 века русский физиолог и биохимик Михаил Семенович Цвет первым использовал этот феномен. Пропуская экстракт из листьев через вертикальную трубку, заполненную адсорбирующим порошком, он сумел разделить основные пигменты листьев – зеленый и оранжевый – и получить их в виде отдельных окрашенных полос или колец вдоль трубки. Свой метод он назвал хроматография (греч. khroma – цвет, graphein – записывать). Цвет умер относительно молодым и потенциальные возможности его метода оставались неиспользованными до начала 40-х гг. Сейчас существует множество вариантов хроматографии – применимой ко всем веществам, которые могут быть идентифицированы химически. Близким к хроматографии является электрофорез в геле, при котором не поток растворителя, а электродвижущая сила способствует передвижению и разделению электрически заряженных компонентов. Эти методы произвели переворот в области химического анализа. Теперь на следовых количествах смеси практически любого состава можно провести анализ. Вторым методом, радикально изменившем химическое исследование живых клеток, явился метод изотопного мечения. Изотопы – это разновидности одного и того же химического элемента, отличающиеся по атомной массе. Некоторые изотопы существуют в природе, многие могут быть получены искусственным путем в процессе ядерных реакций. Изотопы используются для специфического мечения определенных молекул, такие молекулы можно отличить от им родственных без нарушения общей структуры. Этот метод используется при анализе биосинтетических процессов, которые не могли быть изучены другим способом. Например, с получением меченых аминокислот появилась возможность изучать их соединение в белки в живом организме или в экспериментальных условиях, даже, несмотря на бесконечно малое количество вновь образованного белка, благодаря его радиоактивности. Широкое распространение этот метод получил с созданием атомных реакторов и производством широкого спектра радиоизотопов. Без метода меченых атомов достижения клеточной и молекулярной биологии были бы невозможны. Таким образом, и морфология, и биохимия, обогащенные новыми методами постоянно совершенствовались, разрыв между их знанием становился все меньше и исчез совсем, когда появилась возможность разделить клетку на части таким образом, чтобы каждую часть можно было бы независимо изучить. Методы, применяемые для такого фракционирования, основываются главным образом на центрифугировании. Этот метод использует различия в физических свойствах, в частности величине и плотности, тех или иных составных частей клетки для отделения их друг от друга. Это позволило изучить большую часть клетки и объединить морфологическое и биохимическое знание. Однако одна часть клетки – ее важнейшая центральная часть, ядро – оставалась в значительной степени недоступной, пока не произошло еще одно событие. А началось оно с попытки проанализировать с помощью генетики особенности некоторых простых вирусов, инфицирующих бактерии и названные бактериофагами или пожирателями бактерий. Это исследование оказалось верным подходом к решению проблемы генетической организации, которая даже у простейших неклеточных организмов была необыкновенно сложной. Длительное время новая дисциплина известная сегодня как молекулярная биология, ограничивалась изучением вирусов и бактерий, но затем она буквально ворвалась в эукариотическую клетку, позволив изучать регуляцию жизнедеятельности клетки.

    Для изучения молекулярных основ организации клетки необходим детальный биохимический анализ. Для него необходимо значительное количество клеток определенного типа, поэтому невозможно использовать кусочки ткани, ведь они содержат клетки разных типов. На первом этапе работы кусочки ткани превращают в суспензию.

    Это можно сделать, разрушив межклеточное вещество и межклеточные связи. Для этого ткань обрабатывают протеолитическими ферментами, разрушающими белки (трипсин, коллагеназа). В соединении клеток, их слипании большую роль играет кальций, поэтому используют и вещества хелатирующие, которые связывают кальций.

    Затем ткани подвергают мягкому механическому разрушению и разделяют на отдельные клетки. Второй этап – разделение суспензии на отдельные фракции.

    Для этого используют центрифугирование, с помощью которого крупные клетки отделяют от мелких, а легкие – от тяжелых или используют антитела, и способность клеток с разной прочностью прикрепляться к стеклу или пластмассе. Третий этап – введение выделенных клеток в культуру. Первые опыты были проведены в 1907 г.

    Гаррисоном, он культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Среды для культивирования имеют довольно сложный состав. Стандартная среда была разработана в начале 70-х, она содержит набор из 13 аминокислот, 8 витаминов, минеральные соли. Кроме того, в среду могут включаться глюкоза, пенициллин, стрептомицин, сыворотка лошади или теленка.

    Как показали Хайфлик и Мурхед в 1961 г., большинство клеток млекопитающих погибает в культуре после определенного числа делений. Клетки кожи человека делятся в культуре 50-100 раз. Однако в культуре иногда появляются мутантные клетки, которые могут размножаться бесконечно, образуя клеточную линию. В 1952 г.

    была выделена перевиваемая клеточная линия из раковой опухоли шейки матки, известная как линия HeLa. Такие линии хранят при температуре -70 С, после размораживания они сохраняют способность делиться. Метод культивирования растительных клеток был разработан к 1964 г. Пользуясь им, удалось вырастить in vitro целое растение моркови из клеток корня.

Источник: https://media.ls.urfu.ru/203/592/1237

Vse-referaty
Добавить комментарий